التركيبية تحليل شامل لجدران الخلايا النباتية (الكتلة الحيوية Lignocellulosic) الجزء الثاني : الكربوهيدرات
مارس 12, 2010
الكتلة الحيوية النباتية هي كبيرة خالية من الكربون الموارد المتجددة التي يمكن استخدامها لانتاج الوقود الحيوي. الكتلة الحيوية النباتية يتكون أساسا من جدران الخلايا ، والمواد المركبة المعقدة هيكليا ووصف lignocellulosics. نحن هنا وصف بروتوكول لإجراء تحليل شامل للمحتوى الكربوهيدرات وتكوين جدار مشتقة.
تحديد تركيبة عديد السكاريد المصفوفة ومحتوى السليلوز البلوري لجدران الخلايا النباتية بالمواد النباتية المجففة ، والتي تخضع لعمليات استخراج مختلفة. تتكون المادة الناتجة من جدران الخلايا فقط ثم يتم تقسيمها لتحديد تركيبة عديد السكاريد المصفوفة. تتم معالجة مادة الجدار بحمض ضعيف للتحلل المائي ، والسكريات غير البلورية ، والتي هي بشكل أساسي السليلوز الدموي في السكريات الأحادية.
ثم يتم اشتقاق السكريات الأحادية إلى أسيتات الألدول المتطايرة المقابلة لها ، والتي يتم تحليلها بعد ذلك وقياسها كميا بواسطة كروماتوغرافيا الغاز المقترنة بمطياف الكتلة لتحديد السليلوز البلوري. تتم معالجة جدران المحتوى باستخدام كاشف الرسم البياني ، وهو مزيج من الأحماض التي تزيل مكونات الجدار غير البلورية. يتحلل السليلوز البلوري المتبقي إلى جلوكوز مونومر ، والذي يمكن فحصه ، مقطورا متريا.
يتم توضيح تحديد محتوى اللجنين وتكوينه في منشور فيديو J آخر بعنوان التحليل التركيبي الشامل لجدران الخلايا النباتية ، الجزء الأول من اللجنين. مرحبا ، أنا ماركوس باولي ، رئيس منشأة الجدار التحليلية في مركز أبحاث الطاقة الحيوية في البحيرات العظمى هنا في جامعة ولاية ميشيغان. أنا كليف فوستر ، مدير منشأة Cell Wall Analytical .
سنوضح لك اليوم كيفية تحديد تركيبة السكريات الموجودة في مادة جدار الخلية النباتية وهي السليلوز في العديد من السليلوز الهوميو. هنا في مركز أبحاث الطاقة الحيوية في البحيرات العظمى ، نقوم بتطوير تقنية لتحويل هذه السكريات إلى وقود حيوي. من أجل تحديد المادة الأولية النباتية المثلى ، نحتاج أولا إلى تقييم نوع ووفرة السكريات الموجودة في هذه الكتلة الحيوية.
في مقطع فيديو آخر بعنوان التحليل التركيبي الشامل لجدران الخلايا النباتية ، الجزء الأول من اللجنين ، سنركز على تحليل البوليفينول. لذلك دعونا نبدأ. ابدأ هذا الإجراء بعزل جدران الخلايا.
قمبطحن ما يقرب من 60 إلى 70 ملليغرام من المواد النباتية المجففة باستخدام كرات من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 5.5 ملم في أنبوب غطاء لولبي TED سعة ملين ر.س. باستخدام مطحنة REM كبديل عالي الإنتاجية ، استخدم روبوت طحن وتوزيع يسمى جدار العين كما هو موضح في الجزء الأول. عند اكتمال الطحن ، قم بإزالة الكرات الفولاذية.
استمر في عزل جدران الخلايا وإزالة النشا المتبقي كما هو موضح في الجزء الأول والموضح في البروتوكول المكتوب المصاحب. قم بوزن ملليغرامين من مادة جدار خلية نشا DS في أنبوب ساريد بمطحنتين. طريقة عالية الإنتاجية لأداء هذه المهمة هي روبوت جدار العين.
يأخذ الروبوت أنبوبا يحتوي على مادة نباتية مطحونة ويصنع ثقبا في قاع الأنبوب. ثم يتم وضع الأنبوب المثقوب على وحدة تغذية VI. يتم وضع أنبوب فارغ على ميزان ويتم تحريكه تحت وحدة التغذية VI من خلال مادة الاهتزاز التي تتسرب من خلال الفتحة الموجودة في الأنبوب العلوي المحمل إلى الأنبوب السفلي الفارغ حتى تتراكم الكمية المطلوبة من المواد.
أضف 100 ميكروغرام من الأسيتول كمعيار داخلي. شطف جدران الأنبوب مع الأسيتون لجمع مادة جدار الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب وتبخير الأسيتون برفق شديد تحت تدفق الهواء. بعد ذلك ، قم بإجراء التحلل المائي الحمضي الضعيف.
أضف بعناية 250 ميكرولترا من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك المولي أو TFA إلى كل عينة ، مع التأكد من عدم رش أي مادة على جدران الأنبوب. قم بتغطية الأنابيب بإحكام واحتضانها عند 121 درجة مئوية في كتلة تسخين لمدة 90 دقيقة. ثم قم بتبريد كتل التسخين والعينات على الجليد وقم بالطرد المركزي للأنابيب عند 10 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.
انقل 100 ميكرولتر من المادة الطافية الحمضية التي تحتوي على السكريات القابلة للذوبان من عديد السكاريد المصفوفة إلى قوارير الغطاء اللولبي ، مع التأكد من عدم إزعاج مادة الحبيبات. يمكن استخدام الحبيبات لمقايسة السليلوز البلورية. تبخر TFA في أنبوب زجاجي تحت تيار لطيف من الهواء في جهاز التبخر.
أضف 300 ميكرولتر من اثنين من البروبانول لإزالة دوامة الحمض الزائدة وتبخر عند 25 درجة مئوية. كرر لمدة ثلاث مرات. من أجل تمكين تحديد السكريات الأحادية عن طريق كروماتوغرافيا الغاز ، قم بإجراء اشتقاق أسيتات ألدول.
أولا ، قم بتقليل السكريات الأحادية إلى الدولات ذات الحلقة المفتوحة المقابلة لها ، والتي يتم بعد ذلك أسيتيلها. راجع البروتوكول المكتوب المصاحب للحصول على تعليمات مفصلة. تتبع كل خطوة من خطوات الإجراء البروتوكول الموضح سابقا ، إضافة تبخر حضانة الكاشف تحت تيار من الهواء ، متبوعا بإزالة الكاشف الزائد بخطوات غسيل مختلفة.
في الخطوات النهائية ، يتم استخراج أسيتات الألدول. أولا ، أضف 500 ميكرولتر من أسيتات الإيثيل وقم بتحريكها برفق. ثم أضف ملتين من الماء ، وقم بتغطية الأنابيب والدوامة ، وقم بالطرد المركزي للأنابيب عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق للحصول على طبقات منفصلة واضحة مع أسيتات الإيثيل في الأعلى تحتوي على أسيتات الديتول والماء على الماصة السفلية 50 ميكرولتر من طبقة أسيتات الإيثيل في قوارير GCMS مع إدخالات مخففة عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من الأسيتون إلى قارورة GC ويمكن تخزين قارورة GC عند أربع درجات مئوية.
إذا لم يستمر تحليل GCMS على الفور ، فقم بحقن العينات في مصور كروما الغاز المجهز بمطياف كتلة رباعي. للحصول على عمود وتفاصيل الجري ، يرجى الرجوع إلى البروتوكول المكتوب المصاحب. يمكن أن تكون المادة الأولية لتحديد محتوى السليلوز البلوري عبارة عن مادة جدار الخلية المعزولة أو مادة الجدار المعالجة بالفعل بحمض TFA الضعيف ، إما مباشرة بعد المعالجة الحمضية أو في شكل مجفف قابل للتخزين.
بعد إزالة TFA الزائد مع iso propanol كما هو موضح سابقا ، أضف إلى حبيبات TFA في اثنين من M sars إلى أنبوب واحد M من كاشف degra المكون من حمض الخليك وحمض النيتريك والماء ، أضف نسبة من ثمانية إلى واحد إلى اثنين من الحجم إلى الحجم. قم بتغطية الأنبوب بإحكام وتسخينه على كتلة تسخين على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. نتيجة لهذا العلاج ، يبقى السليلوز البلوري فقط في الحبيبات.
جميع السكريات الأخرى هي عينات باردة متحللة في الكتلة على الجليد إلى درجة حرارة الغرفة أو أكثر برودة. ثم الطرد المركزي للعينات عند 10 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة بعد الطرد المركزي ، وتخلص من المادة الطافية لضمان عدم إزعاج الحبيبات وإزالة أي مادة من الحبيبات. لهذا الغرض ، اترك ما يقرب من 150 ميكرولتر من المادة الطافية في الأنبوب ، واغسل الحبيبات عدة مرات بالماء.
بعد ذلك ، قم بإجراء نفس الشيء والتحلل المائي بحمض الكبريتيك المركز من أجل تحلل حبيبات البلورات والسليلوز بالكامل إلى جلوكوز. ابدأ بإضافة 175 ميكرولترا من حمض الكبريتيك بنسبة 72٪ إلى أنبوب سارتا واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة الأولية ، قم بدوامة العينة واحتضانها لمدة 15 دقيقة أخرى.
ثم أضف 825 ميكرولتر من الماء والدوامة وقم بالطرد المركزي للعينات عند 10 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. قد يكون هناك بعض المواد البنية والقابلة للذوبان ، معظمها من اللجنين المتبقية في الأنبوب بينما يكون الجلوكوز في المادة الطافية. يتم فحص محتوى الجلوكوز في المادة الطافية باستخدام مقايسة الأنثون الملونة.
يتم إجراء هذا الاختبار في صفيحة ميكروتيتر البوليسترين 96 جيدا. قم بإصلاح منحنى الجلوكوز القياسي في نسختين باتباع التعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب المصاحب. قم بإعداد العينات عن طريق الجمع بين 10 ميكرولتر من كل عينة ، سوبرنات و 90 ميكرولتر من الماء في آبار منفصلة من نفس لوحة الميكروتيتر مثل التشطيب القياسي عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من الكاشف المحضر والطازج.
بعد ذلك ، سخني الطبق لمدة 30 دقيقة عند 80 درجة مئوية في فرن به موزع حراري من الألومنيوم. لاحظ أن العينات المحتوية على الجلوكوز تتحول من الأصفر إلى الأخضر الأزرق عند اكتمال التسخين. دع الطبق يبرد إلى درجة حرارة الغرفة ورجه جيدا.
اقرأ الامتصاص عند 625 نانومتر باستخدام قارئ لوحة ميكروتيتر. يتم حساب محتوى الجلوكوز ، اللبنة الأساسية للسليلوز بناء على الامتصاص مقارنة بالمنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه على نفس اللوحة. فيما يلي بعض النتائج التمثيلية لتحليل عديد السكاريد لقطعة من خشب الحور.
يتم تحديد قمم كروماتوجرام الغاز من خلال ملامح الكتلة و / أو أوقات الاحتفاظ بالمعايير. يتم قياس السكريات الأحادية بناء على المنحنيات القياسية. يظهر تحليل السكر لعديد السكاريد المصفوفة وفرة عالية من الزيلوز الذي يمثل hemi cellulose xam ، ولكن توجد أيضا سكريات أخرى.
وفقا للتحليل ، يتكون 40٪ من مادة الحور من الكريستال والسليلوز. يرجى ملاحظة أن هذه المحتويات والتركيبات يمكن أن تختلف من نبات إلى آخر أو بين تشريح النبات المختلف. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تحديد محتوى السكريات والتحليل التركيبي للكتلة الحيوية السليلوزية ليجنانو لتحليل لجنين البوليفينول.
استمع إلى الجزء الأول. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
الموجز
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لتحليل تركيب الكربوهيدرات المشتقة من جدران الخلايا النباتية، مع التركيز على اللجنين والسليلوز. تتضمن الطريقة استخلاص وقياس السكريات المتعددة المصفوفة والسليلوز البلوري من المواد النباتية المجففة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا النبات
- تحليل الكتلة الحيوية
- إنتاج الوقود الحيوي
الخلفية
- الكتلة الحيوية النباتية هي مورد متجدد لإنتاج الوقود الحيوي.
- تتكون جدران الخلايا أساسًا من اللجنين والسليلوز، وهي مواد معقدة.
- فهم تركيبها أمر بالغ الأهمية لتحسين المواد الخام لوقود الوقود الحيوي.
- تركز هذه الدراسة على تحليل السكريات المتعددة ومحتوى السليلوز.
هدف الدراسة
- لتطوير بروتوكول شامل لتحليل الكربوهيدرات في جدران الخلايا النباتية.
- لتقييم تركيب السكريات الموجودة في الكتلة الحيوية لتطبيقات الوقود الحيوي.
- لتوفير طريقة لتحديد محتوى السليلوز البلوري.
الطرق المستخدمة
- عزلة جدران الخلايا من المواد النباتية المجففة.
- تحليل هيدروليسي بالحمض الضعيف لإطلاق السكريات الأحادية.
- كروماتوغرافيا الغاز-الطيف الكتلي (GC-MS) للتحليل.
- تحديد كمي لمحتوى السليلوز البلوري واللجنين.
النتائج الرئيسية
- استخراج ناجح للسكريات المتعددة المصفوفة من جدران الخلايا النباتية.
- تحقيق تحديد كمي للسكريات الأحادية والسليلوز البلوري.
- بروتوكول ثبت فعاليته في تقييم تركيب الكتلة الحيوية النباتية.
- مكاسب ثاقبة لتحسين اختيار المواد الخام لوقود الوقود الحيوي.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لتحليل الكربوهيدرات في جدران الخلايا النباتية.
- فهم تركيب السكريات المتعددة أمر حيوي لتطوير الوقود الحيوي.
- تساهم هذه الدراسة في مجال أبحاث الطاقة المتجددة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of plant cell wall carbohydrates enables rational selection of lignocellulosic feedstocks for biofuel production, directly impacting process efficiency and yield optimization. This analytical approach supports early-stage de-risking by providing compositional data that informs pretreatment and enzymatic hydrolysis strategies. Feedstock variability necessitates robust characterization to ensure consistent performance in downstream biorefining operations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of biomass recalcitrance through detailed monosaccharide and cellulose profiling.
- Operational Value: Provides quantitative outputs for comparing genetic or phenotypic variants in energy crop development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized carbohydrate profiles suitable for high-throughput screening of biomass traits.
- Operational Value: Establishes reproducible workflows for monosaccharide derivation and GC-MS quantification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links cell wall composition to theoretical ethanol yield, supporting feedstock prioritization.
- Operational Value: Delivers glucose-equivalent data from crystalline cellulose assays for mass balance modeling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-feedstock optimization continuum, where carbohydrate analysis precedes pretreatment screening and hydrolysis efficiency testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how cell wall architecture affects enzyme accessibility.
- Screening: Enables assay-ready biomass panels with quantified sugar release potential.
- Analytics: Delivers monosaccharide and glucose metrics that inform hydrolysis kinetics and yield predictions.
- Translational Research: Connects compositional data to biofuel process modeling for scale-up decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a centralized analytical service for multi-project feedstock evaluation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in biomass recalcitrance by defining compositional variables.
- Operational Value: Ensures standardization across labs via defined hydrolysis, derivatization, and quantification steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions on feedstock advancement through predictive sugar yield estimates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of biomass sources based on carbohydrate composition and crystallinity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in carbohydrate chemistry and GC-MS operation for accurate monosaccharide identification.
- Depends on hydrolysis blocks, centrifuges, and evaporation systems for sample preparation.
- Necessitates standardization of internal standards (e.g., acetol) and reagent volumes across batches.
- Must account for feedstock-specific variability in lignin and ash content that may interfere with assays.
- Limited to non-starch polysaccharides; residual starch must be removed prior to analysis as per protocol.
![غليكان التنميط من البوليمرات جدار الخلية النباتية باستخدام [ميكروأرس]](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F4238.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A08.571Z&w=384&q=75)
