يعاير قدرة إنتشاري جزيئات إشارة إلى إعادة توجيه الجنينية محاور عصبية صواري العمود الفقري

يتم تشريح مستنبتات من الحبل الشوكي الظهري من أجنة الجرذان وزراعتها في هلام كولاجين ثلاثي الأبعاد في مواجهة خلايا تعبر عن جزيء إشارة مرشح. ثم يتم تقييم قدرة جزيء الإشارة على إعادة توجيه المحاور العصبية التي تنمو داخل مستنبت الحبل الشوكي الظهري باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية.

مرحباً، أنا فيرجينيا هازن من مختبر سامانثا بتلر في قسم العلوم البيولوجية بجامعة جنوب كاليفورنيا. وأنا كيث فون أيضاً من مختبر بتلر. وأنا كين يا ماي من مختبر بتلر.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لاستزراع غرسات النخاع الشوكي الظهري وتجمعات خلايا العقد الجذرية الخلفية المنقولة جينياً في مصفوفة كولاجين. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لتقييم قدرة الجزيئات المرشحة على توجيه العصبونات الشوكية. وفي هذه التجربة، سنقوم بفحص قدرة البروتين المكون للعظم أو BMP 7 على العمل كطارد كيميائي.

لنبدأ الآن. قم بتحضير تجمعات خلايا co المستخدمة لتحدي مسار محاور العصبونات choral من خلايا co. والمعدلة وراثياً باستخدام بلازميد التعبير للجزيء المستهدف هنا، وهو البروتين المكون للعظم أو BMP seven.

قم بشفط الوسط من الطبق واغسل الخلايا بـ 1 mL من 1XPBS. تخلص من الـ PBS وعالج الخلايا بـ 0.5 mL من وسط تفكيك الخلايا الخالي من الإنزيمات لمدة 15 دقيقة. أوقف التفاعل بإضافة 1 mL من الوسط المحتوي على مصل جنين البقر.

باستخدام رأس ماصة سعة 1000 ميكرولتر، كرر عملية سحب الخلايا حتى لا يتبقى أي منها على سطح طبق الزرع. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مللي لتر وقم بترسيب الخلايا لمدة دقيقتين. عند سرعة 2000 RPM، قم بإزالة السائل الطافي واستخدم الماصة في سحب ورفع السائل لإعادة تعليق الخلايا.

في 100 µL من الوسط، ضع عدة قطرات بحجم 20 µL من محلول الخلايا على السطح الداخلي لغطاء طبق زراعة بقطر 35 mm. أغلق الغطاء فوق الطبق وضعه في الحاضنة لعدة ساعات للسماح للخلايا بالتكتل. لتحضير غرسات النخاع الشوكي الظهرية، احتفظ بها محصودة حديثاً.

وضع أجنة الجرذان في المرحلة E 11 على الثلج. وفي وسط L 15، وبواسطة إبرة تنگستن مدببة، يتم إزالة مقطع يتكون من أربعة إلى ستة قطع جسدية من منطقة الجذع مباشرة أسفل برعم الطرف الأمامي لكل جنين. وباستخدام ماصة بلاستيكية، يتم جمع الأنسجة في بئر واحدة من أربعة آبار.

ضع الطبق على الثلج. وعندما يتم تشريح جميع القطع، استخدم الماصة لنقل القطع إلى بئر ثانٍ في الطبق الذي يحتوي على وسط L 15 مضافاً إليه عجينة القرص. حضّن الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تزيد عن خمس دقائق.

لمنع موت الخلايا، تجنب الإفراط في هضم النسيج. أضف 1 mL من وسط L 15 الطازج مع 5% من مصل الماعز المثبط حرارياً إلى البئر الثالث في الطبق. ثم انقل قطع النسيج إلى هذا البئر.

في نهاية فترة الحضن في مساحة التفكك، اترك النسيج ليرتاح على الثلج لمدة ساعة. ولتسهيل عملية التشريح اللاحقة في أنبوب طرد مركزي دقيق، أضف 40 µL من الوسط الأساسي الأدنى بتركيز 10x إلى 360 µL من الكولاجين. ثم استخدم جهاز الـ vortex لفترة وجيزة للمزج، ثم قم بعملية الترسيب باستخدام جهاز pico fuge.

سيكون المحلول أصفر اللون ويجب حفظه على الثلج قدر الإمكان لمنع تخثر الكولاجين؛ وبالنسبة لكل دفعة من الكولاجين، يتم معايرتها بكمية من بيكربونات الصوديوم بتركيز 0.8 molar حتى يتحول لون محلول الكولاجين إلى البرتقالي الفاتح، مع خلط المحلول بعد كل إضافة. عندما يصل محلول الكولاجين إلى هذا اللون، سيبقى سائلاً إذا حُفظ على الثلج، ولكنه سيكون مهيأً للتخثر عند نقله إلى درجة حرارة الغرفة. إذا تحول المحلول إلى اللون الوردي بعد الخلط، ابدأ من جديد باستخدام أنبوب كولاجين جديد، ثم وزع 20 µL من الكولاجين في كل بئر من بئر طبق نظيف ذي أربعة آبار.

باستخدام طرف الماصة، قم بتوزيع الكولاجين لتشكيل وسادة صغيرة. اترك الكولاجين يتصلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق تقريبًا. وتحت مجهر التشريح، استخدم إبرة تنجستن مبرودة حديثًا وملقطًا دقيقًا لإزالة الأديم المتوسط المحيط بالنخاع الشوكي من جنين واحد باستخدام إبرة التنجستن، ثم قم بإزالة الجزء البطني من النخاع الشوكي، والذي يمكن تمييزه بوجود الصفيحة الأرضية.

عند الحافة البطنية القصوى، تكون الصفيحة الأرضية أكثر سمكاً قليلاً من الصفيحة السقفية عند الحافة الظهرية. في هذا المثال، يكون الحبل الشوكي موجهاً بحيث يكون الجانب البطني للأسفل. قم بقطع النسيج بعناية بالتوازي مع الصفيحة الأرضية وتخلص من الخُمس البطني من الحبل الشوكي.

استخدم الإبرة لشق تفسيخ الحبل الشوكي الظهري عمودياً. تأكد من أن الحواف مقطوعة بدقة قدر الإمكان وأعد تهذيبها إذا لزم الأمر. استخدم ماصة فموية مثبت بها أنبوب شعري زجاجي بقطر 0.5 millimeter لنقل كل x explan إلى وسادة كولاجين منفصلة.

باستخدام إبرة التنجستن، يتم تقطيع تجمعات خلايا co المنقولة جينياً إلى مربعات يكون عرضها تقريباً مساوياً لعرض الحافة الجانبية للنخاع الشوكي الظهري.Explan. استخدم ماصة فموية لنقل أحد المربعات إلى وسادة الكولاجين مع x explan. استخدم الماصة الفموية لسحب أي سائل زائد.

تجنب السحب الزائد لأن كمية صغيرة من السائل ستساعد في عملية تطبيق الكولاجين اللاحقة، ثم ضع 4 µL من الكولاجين المجهز على الوسادة. استخدم إبرة التنجستن لتحريك الكولاجين فوق الغرسات دون لمس الأنسجة بشكل مباشر. ومن خلال تحريك الإبرة في الكولاجين، قم بتوجيه كل x explan بحيث تكون تجمعات الخلايا co مجاورة لحافته الجانبية.

اترك الكولاجين ليتماسك لمدة تتراوح من 15 إلى 20 دقيقة. كرر عملية التطبيق بإضافة أربعة ميكرولترات أخرى من الكولاجين لضمان تغليف الـ x explan بالكامل بالكولاجين، قبل الانتقال إلى الجنين التالي داخل غطاء زراعة الأنسجة في 0.5 milliliters من الوسط الغذائي، ثم يتم الاستزراع لمدة تتراوح من 30 إلى 40 ساعة في الحاضنة. وفي خزانة استخلاص الغازات، يتم تثبيت المستنبتات باستخدام 0.5 milliliters من محلول Para formaldehyde بتركيز 4% في PBS لمدة 45 دقيقة. مع الحفاظ على النسيج مبرداً على الثلج، اغسله مرتين باستخدام 0.5 milliliters من محلول الحجب والنفاذية PBTN.

قم بحضن المستنبتات x في محلول الحجب عند درجة حرارة أربع درجات مئوية، ويفضل أن يكون ذلك طوال الليل. استخدم الملاقط لإخراج المستنبت X من الطبق ذي الثقوب الأربعة، وضع كل واحد منها في ثقب واحد من طبق يحتوي على 48 ثقباً.

أضف 200 µL من الأجسام المضادة الأولية إلى كل بئر. ولتصوير المحاور العصبية المشيمية، استخدم جسم مضاد mouse anti ttag، ولتحديد ما إذا كان ترانسفكشن الخلايا المتقاطعة ناجحاً، قم بتضمين جسم مضاد ضد الجزيء الذي يتم اختباره. قم بالتحضين طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C.

اغسل كل عينة في محلول حجب PBTN خمس مرات، ولمدة ساعة واحدة لكل غسلة عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. أزل PBTN وأضف 200 microliters من الجسم المضاد الثانوي إلى كل بئر. غطِّ الأطباق برقائق الألومنيوم لمنع التبييض، ثم قم بالتحضين طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات Celsius.

اغسل العينات خمس مرات في PBTN كما سبق. انقل كل مقطع نسيجي إلى شريحة ذات ثلاثة تجاويف. تخلص من السائل الزائد، ثم ضع وسط Invecta Shield للتثبيت وغطِّها بغطاء الشريحة.

قم بتخزين الشرائح في مجلد أو صندوق محمي من الضوء عند درجة حرارة 4 أو -20 درجة Celsius حتى يحين وقت فحصها بالمجهر. سنعرض الآن بعض الصور التمثيلية لمستنبتات x بعد زراعتها وتثبيتها وصبغها وتصويرها باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy). يوضح اللوح A أن مستنبت X للصفيحة السقفية (roof plate) المحدد باللون الأبيض يمكنه إعادة توجيه المحاور الشوكية choral الموجبة للعلامة 1 بعيداً عنه، مما يثبت أن الصفيحة السقفية هي مصدر لمادة طاردة كيميائياً للمحاور العصبية. ويوضح اللوح B أن الخلايا التي تفرز جزيء إشارة M، وهو البروتين المكون للعظم أو BMP7، يمكنها طرد المحاور الشوكية carceral بطريقة مماثلة للصفيحة السقفية.

ليس للخلايا التي تفرز بلازميد التعبير فقط أي تأثير على توجيه المحاور العصبية. لقد شرحنا لك للتو كيفية تشريح وتوجيه وزراعة مستأصل من الحبل الشوكي وتكوين تجمعات خلوية تسمح لك بتحديد ما إذا كان جزيء إشارات مرشح يمتلك نشاطاً لإعادة توجيه المحاور العصبية. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم الحفاظ على الكولاجين مبرداً على الثلج قدر الإمكان، وتغليف المستأصل بالكامل بالكولاجين بحيث لا يتلامس بشكل مباشر مع أوساط الزراعة.

وفي الختام، استمر في الزرع فقط للفترة الزمنية اللازمة لتمتد المحاور العصبية إلى الحافة البطنية لـ x explan. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.