تحديد الظواهر المستحثة بواسطة تثبيط النمو البكتيري نوع من التعبير المستجيبات الثالث في الخميرة

لبدء هذا البروتوكول، اختر ناقلاً للتعبير عن المؤثر البكتيري المفضل لديك. وفي الخميرة وسلالة الخميرة، يتم بعد ذلك تحويل الناقل إلى خلايا الخميرة. ثم يتم تحفيز التعبير عن المؤثر.

يتم تحلل الخلايا المُحفزة لإجراء تحليل لطخة ويسترن (western blot) لاحقاً للتحقق من تعبير البروتين المؤثر. وبعد التأكد من تعبير البروتين المؤثر، يتم إنماء الخلايا وعمل تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف، ثم تُنقط على أوساط غذائية كابتة ومُحفزة. وأخيراً، يتم تحليل نمو الخميرة بعد مرور يومين إلى ثلاثة أيام.

مرحباً، أنا دو سولومون من مختبر الدكتور جيدو سيسا في قسم علوم النبات بجامعة تل أبيب. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحديد أنماط تثبيط النمو الناتجة عن تعبير المؤثرات البكتيرية من النوع الثالث في الخميرة. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة وظيفة المؤثرات من النوع الثالث المستمدة من البكتيريا الممرضة سالبة الجرام، وهي أداة تساعدنا في تحديد أهداف المؤثر TIC.

لنبدأ الآن. هناك عدة عوامل مهمة يجب مراعاتها وتحسينها عند تصميم نظام خميرة مناسب للتعبير عن المؤثرات من النوع الثالث محل الاهتمام. العامل الأول هو المحفز الذي يقود التعبير عن هذه المؤثرات.

بما أن المؤثرات البكتيرية من النوع الثالث قد تكون سامة لخلايا الخميرة، يجب استخدام محفز قابل للاستحثاث للتحكم في تعبيرها. وسنستخدم المحفز GAL one في هذه التجربة. أما العامل الثاني فهو عدد نسخ جين المؤثر.

يتم تحقيق مستويات تعبير عالية عندما يكون الجين المؤثر محمولاً على بلازميد ميكرونين (two micron plasmid). ويتم الحصول على تعبير متوسط باستخدام بلازميد يحتوي على سنترومير، بينما يتم تحقيق تعبير منخفض عندما يتم دمج الجين المؤثر في جينوم الخميرة عن طريق إعادة التركيب المتماثل. أما العامل الثالث الذي يجب مراعاته فهو وسم الإبيتوپ (epitope tag) المستخدم للتحقق من تعبير البروتين في الحالات التي لا تتوفر فيها أجسام مضادة للمؤثر المطلوب.

تُستخدم عادةً وسوم مثل M hemagglutinin HA أو flag والتي تتوفر لها أجسام مضادة تجارية موثوقة. ونقترح استخدام نسخة واحدة فقط من الوسم لتقليل التأثيرات الضارة غير المرغوب فيها على بنية ونشاط البروتين المؤثر. وأخيراً وليس آخراً، يجب أن تكون سلالة الخميرة المستخدمة للتعبير جينية الاستجابة للمؤشر الانتقائي لناقل التعبير.

لتنمية خلايا الخميرة من أجل عملية التحول، اختر مستعمرة خميرة من طبق حديث العهد وقم بتلقيح 3 mL من وسط YPD في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 mL باستخدام جهاز الفورتيكس. ضع أنبوب المزرعة لفترة وجيزة في جهاز الدوران (roller) واحضنه طوال الليل عند 30 °C مع الدوران المستمر. وفي الصباح التالي، أخرج المزرعة من جهاز الدوران وقم بطردها مركزياً عند 800 Gs لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة الطافي تماماً وأعد تعليق الخلايا في 1 ml من منظم تعليق Resus، مع الخلط باستخدام جهاز الفورتكس بأقصى سرعة لمدة 10 ثوانٍ تقريباً. لكل بلازميد سيتم تحويله، بالإضافة إلى تحويل ضابط إضافي، انقل 100 µl من معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. أضف 5 µl من DNA حيوانات السلمون أحادي الخيط، ومن 250 إلى 500 ng من DNA البلازميد إلى كل أنبوب باستثناء الأنبوب الضابط.

بعد ذلك، أضف بعناية 650 µL من محلول التحول إلى كل أنبوب مع الرج بجهاز الفورتيكس. يتم تحضين الأنابيب عند 30 °C لمدة 30 دقيقة على جهاز الدوران (roller). وعند اكتمال التحضين، أضف 70 µL من DMSO إلى كل أنبوب، واخلط عن طريق قلب الأنابيب من 10 إلى 15 مرة لتجنب تكسر الخلايا.

لا تقم برج الأنابيب بجهاز الفورتيكس. ضع الأنابيب في حمام مائي مُدفأ مسبقاً عند درجة حرارة 42 degree Celsius واحضنها لمدة 15 minutes. بعد مرور 15 minutes، أخرج الأنابيب من الحمام المائي وضعها فوراً على الثلج لمدة دقيقتين.

بمجرد أن تبرد الأنابيب، يتم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي، ثم تُستخدم الماصة لإزالة السائل الطافي اللزج بعناية. يتم إعادة تعليق كل راسب في 150 µL من الماء المقطر المزدوج المعقم، وتُفرد معلق الخلايا على طبق يحتوي على الوسط الانتقائي المناسب. تُترك الأطباق مفتوحة لمدة دقيقتين وتُترك لتجف داخل غطاء التدفق الصفائحي.

بعد ذلك، توضع الأطباق في حاضنة بدرجة حرارة 30 °C لمدة تتراوح بين يومين وثلاثة أيام لنمو خلايا الخميرة. ولتحضير مستخلص بروتيني، يتم تلقيح 3 mL من وسط الكبت المناسب بمستعمرة خميرة من طبق حديث وعمل مزج دوامي (vortex). وفي اليوم التالي، يوضع أنبوب المزرعة لفترة وجيزة في جهاز دحرجة (roller) عند درجة حرارة 30 °C.

أزل المزرعة من الأسطوانة الدوارة واجعلها تخضع للطرد المركزي عند 800 Gs لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم تخلص من الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا. في 3 mL من الماء المقطر المزدوج (DDW) المعقم، امزج المزيج بواسطة جهاز الفورتكس ثم أجربه للطرد المركزي مرة أخرى، وتخلص من الطافي وأعد تعليق الخلايا في 3 mL من الماء المقطر المزدوج (DDW) المعقم. الآن، انقل 200 µL من معلق الخلايا إلى أنبوب جديد سعة 15 mL يحتوي على 3 mL من وسط الحث المناسب، وامزجه بواسطة جهاز الفورتكس.

ضع الأنبوب في جهاز الدوران (roller) واتركه في الحاضنة طوال الليل عند 30 درجة Celsius. وفي صباح اليوم التالي، انقل 1 mL من المزرعة، أو كمية أكبر في حالة المزارع ذات الكثافة المنخفضة، إلى أنبوب طرد مركزي دقيق (micro centrifuge tube). قم بحصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 800 Gs لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة؛ ومن هذه النقطة فصاعداً، يجب العمل داخل خزانة استخلاص الأدخنة (fume hood) لتجنب استنشاق أبخرة Beamer capto ethanol السامة.

قم بإزالة الطافي بعناية باستخدام الماصة، ثم أعد تعليق كتلة الخلايا في 100 µL من محلول التحلل المبرد على الثلج. اخلط المزيج بقوة باستخدام جهاز الـ vortex، ثم اتركه في الحاضنة على الثلج لمدة 30 دقيقة. خلال فترة الحضانة التي تستغرق 30 دقيقة، حدد حجم حمض الهيدروكلوريك العادي سداسي المولارية المطلوب لمعايرة 100 µL من محلول التحلل المنظم حتى يصل pH إلى قيمة تتراوح بين 9 و 10.

للقيام بذلك، أضف أحجاماً مختلفة من حمض الهيدروكلوريك إلى 100 µL من محلول التحلل (lysis buffer) في 10 أنابيب مختلفة، وتحقق من pH المحلول باستخدام شريط مؤشر pH في نهاية فترة التحضين عند الحجم المناسب من حمض الهيدروكلوريك المضاف إلى المستخلص الخلوي، ثم اخلط المزيج باستخدام جهاز الـ vortex. بعد ذلك، أضف 50 µL من محلول عينة بتركيز 3x (three x sample buffer) إلى المستخلص الخلوي واخلطه باستخدام جهاز الـ vortex، ثم اصنع ثقباً في غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق (microfuge tube) باستخدام إبرة، واغلِ محلول المستخلص الخلوي على كتلة تسخين لمدة خمس دقائق. وبعد الغليان، اترك المحلول ليبرد لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم برج محلول المستخلص باستخدام جهاز الـ vortex ثم قم بطرده مركزياً لمدة 10 ثوانٍ. أصبح المستخلص الآن جاهزاً لتحليل الدم المناعي لتهيئة الخلايا من أجل مقايسة التنقيط (spotting assay). قم بتنمية مستنبتات بحجم ثلاثة ملليلتر من كل سلالة كما هو موضح سابقاً في اليوم التالي.

قم بتحضير طبقين يحتويان على وسط تخليقي كامل خالٍ من الليوسين. يجب تدعيم وسط الطبق الأول بـ 2% glucose ووسط الطبق الآخر بـ 2% lactose و 1% raffinose. جفف الأطباق في غطاء تدفق صفائحي معقم في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

قم بحصد الخلايا وإعادة تعليق كل كتلة خلوية في 3 mL من الماء المقطر المزدوج (DDW) المعقم. كرر خطوة الطرد المركزي وأعد تعليق الخلايا مرة أخرى في 3 mL من الماء المقطر المزدوج (DDW) المعقم. حدد الكثافة الضوئية أو OD لكل مزرعة، ثم حضّر معلقات خلوية بحجم 1 mL وبقيمة OD 600 تساوي 1 في أنابيب ميكروفيش معقمة.

بعد ذلك، قم بتحضير ثلاثة تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف من كل معلق خلوي باستخدام ثلاثة أنابيب دقيقة معقمة تحتوي على 900 microliters من DDW المعقم. ضع الأطباق الجافة على شبكة، وبالنسبة لكل مزرعة، قم بتنقيط 10 microliters من التخفيف الرابع في صف واحد. بعد التنقيط، اترك الأطباق مفتوحة داخل كبينة التدفق الصفحي لعدة دقائق.

عندما تجف البقع، غطِّ الأطباق وضعها في حاضنة بدرجة حرارة 30 degree Celsius لمدة تتراوح من يومين إلى ثلاثة أيام. سنعرض الآن نتائج مقايسة تنقيط الخميرة للكشف عن تثبيط النمو. الأنماط الظاهرية الناتجة عن تعبير مؤثرات النوع الثالث هنا، وهي المؤثرات من النوع الثالث، A-V-R-P-T-O hop، و AA one one و AAV RE one الخاصة بالبكتيريا.

تم التعبير عن بروتينات Pseudomonas Riner الممرضة للطماطم من بلازميد يحتوي على سنترومير في سلالة من الخميرة باستخدام وسط كابح. أظهرت سلالات الخميرة التي تحمل البلازميد للتعبير عن A-V-R-P-T-O و HOP AA one one نمواً مماثلاً للسلالة الضابطة التي تحتوي على ناقل فارغ. بينما أظهرت الخميرة التي تحمل AAV RE one نمواً منخفضاً قليلاً، ويرجع ذلك على الأرجح إلى تسرب المروج GAL one والسمية الخلوية العالية لـ AV RE one. وفي ظل ظروف التحفيز، أدى التعبير عن أي من AV E one أو HOP AA one one إلى ظهور نمط تثبيط نمو حاد، تمثل في غياب المستعمرات في جميع التخفيفات. وفي المقابل، لم يؤدِ التعبير عن A-V-R-P-T-O إلى أي تأثير مثبط للنمو.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحديد أنماط تثبيط النمو الناتجة عن تعبير المؤثرات البكتيرية من النوع الثالث في الخميرة. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر اختيار ناقل التعبير وهذه السلالة بعناية، حيث يمكن لكليهما التأثير بشكل كبير على النتائج. بالإضافة إلى ذلك، تذكر استخدام هذه المستعمرات المحولة حديثاً في جميع خطوات الإجراء.

هذا كل شيء. شكراً لكم على المشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.