تحديد الظواهر المستحثة بواسطة تثبيط النمو البكتيري نوع من التعبير المستجيبات الثالث في الخميرة

لبدء هذا البروتوكول ، حدد متجها للتعبير عن المستجيب البكتيري المفضل لديك. في سلالة الخميرة والخميرة ، يتحول الناقل بعد ذلك إلى خلايا خميرة. يتم تحفيز التعبير التالي عن المستجيب.

يتم تحلل الخلايا المستحثة لتحليل اللطخة الغربية اللاحقة للتحقق من التعبير عن المستجيب. بعد التأكد من التعبير عن الخلايا المستجيبة تنمو وعشرة أضعاف ، يتم رصد التخفيف التسلسلي على الوسائط القمعية والتحريض. أخيرا ، بعد يومين إلى ثلاثة أيام ، يتم تحليل نمو الخميرة.

مرحبا، أنا دو سولومون من مختبر الدكتور جويدو سيزا في قسم علوم النبات في جامعة تل أبيب. سنعرض لك اليوم إجراء لتحديد الأنماط الظاهرية لتثبيط النمو الناجمة عن التعبير عن المؤثرات البكتيرية من النوع الثالث في الخميرة. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة وظيفة المؤثرات من النوع الثالث من البكتيريا المسببة للأمراض سالبة الجرام وهي أداة تساعدنا في تحديد أهداف المستجيب TIC.

لذلك دعونا نبدأ. يجب مراعاة العديد من العوامل المهمة وتحسينها عند تصميم نظام خميرة مناسب للتعبير عن المؤثرات من النوع الثالث محل الاهتمام. الأول هو المحفز الذي يقود التعبير عن المؤثرات.

نظرا لأن المؤثرات البكتيرية من النوع الثالث قد تكون سامة لخلايا الخميرة ، فيجب استخدام محفز محفز للتحكم في تعبيرها. سنستخدم مروج GAL واحد في هذه التجربة. العامل الثاني هو رقم نسخة الجين المستجيب.

يتم تحقيق مستويات عالية من التعبير عندما يتم حمل جين المستجيب بواسطة بلازميد بلونين ميكرون. يتم الحصول على التعبير الوسيط باستخدام سنترومير يحتوي على البلازميد ، ويتم تحقيق تعبير منخفض عندما يتم دمج الجين المستجيب في جينوم الخميرة عن طريق إعادة التركيب المتماثل. العامل الثالث الذي يجب مراعاته هو علامة الحاتمة المستخدمة للتحقق من تعبير البروتين في الحالات التي لا تتوفر فيها الأجسام المضادة ضد المستجيب المعني.

العلامات شائعة الاستخدام هي M hemagglutinin HA أو العلم الذي تتوفر له الأجسام المضادة التجارية الموثوقة. نقترح استخدام نسخة واحدة فقط من العلامة لتقليل الآثار الضارة غير المرغوب فيها على بنية ونشاط البروتين المستجيب. أخيرا وليس آخرا ، يجب أن تكون سلالة الخميرة التي سيتم استخدامها للتعبير مدارية للعلامة القابلة للتحديد لمتجه التعبير.

لزراعة خلايا الخميرة للتحول ، اختر مستعمرة خميرة من صفيحة جديدة وقم بتلقيح ثلاثة ملليلتر من YPD في دوامة أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 مل. ضع أنبوب الثقافة لفترة وجيزة في أسطوانة واحتضنه طوال الليل عند 30 درجة مئوية مع دوران مستمر. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة المزرعة من الأسطوانة وجهاز الطرد المركزي عند 800 Gs لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية تماما وإعادة تعليق الخلايا في مليلتر واحد من عازلة تعليق Resus الممزوجة بالدوامة بأقصى سرعة لمدة 10 ثوان تقريبا. لتحويل كل بلازميد وتحويل تحكم إضافي ، قم بنقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب فوج صغير. أضف خمسة ميكرولترات من المنوية أحادية الخيط من السلمون ، والحمض النووي ، و 250 إلى 500 نانوجرام من الحمض النووي للبلازما إلى كل أنبوب باستثناء أنبوب التحكم.

بعد ذلك ، أضف بعناية 650 ميكرولتر من محلول التحويل إلى كل أنبوب ودوامة. احتضان الأنابيب عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأسطوانة. عند اكتمال الحضانة ، أضف 70 ميكرولترا من DMSO إلى كل أنبوب واخلطها عن طريق قلب الأنابيب من 10 إلى 15 مرة لتجنب كسر الخلايا.

لا تقم بدوامة الأنابيب. ضع الأنابيب في حمام مائي دافئ بدرجة حرارة 42 درجة مئوية واحتضنه لمدة 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة ، قم بإزالة الأنابيب من الحمام المائي وضعها على الفور على الجليد لمدة دقيقتين.

بمجرد أن تبرد الأنابيب ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، ثم استخدم ماصة لإزالة المادة الطافية اللزجة بعناية. أعد تعليق كل حبيبات في 150 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج المعقم وانشر تعليق الخلية على طبق مع الوسط الانتقائي المناسب. اترك الألواح مفتوحة لمدة دقيقتين واتركها تجف في غطاء التدفق الرقائقي.

بعد ذلك ، ضع الصفائح في حاضنة 30 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام لنمو خلايا الخميرة. لإعداد مستخلص البروتين تلقيح ثلاثة ملليلتر من وسط القمع المناسب مع مستعمرة الخميرة من صفيحة جديدة ودوامة. ضع أنبوب الثقافة لفترة وجيزة في أسطوانة عند 30 درجة مئوية في اليوم التالي.

قم بإزالة المزرعة من الأسطوانة وأجهزة الطرد المركزي عند 800 Gs لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية. في ثلاثة ملليلتر من DDW المعقم الممزوج بجهاز الطرد المركزي الدوامي ، مرة أخرى ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في ثلاثة ملليلتر من DDW المعقم. الآن انقل 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب جديد سعة 15 مليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من وسط التحفيز المناسب الممزوج بالدوامة.

ضع الأنبوب في أسطوانة واحتضنه طوال الليل عند 30 درجة مئوية في صباح اليوم التالي. انقل ملليلتر واحد أو أكثر من المزرعة للثقافات منخفضة الكثافة إلى أنبوب طرد مركزي صغير. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 800 Gs لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة من هنا فصاعدا العمل في غطاء الدخان لتجنب استنشاق أبخرة الإيثانول السامة Beamer capto.

قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من محلول التحلل المثلج. تخلط بقوة عن طريق الدوامة وتحتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة. خلال فترة الحضانة لمدة 30 دقيقة ، حدد حجم ستة حمض هيدروكلوريك طبيعي مطلوب لتقطيع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى درجة الحموضة من تسعة إلى 10.

للقيام بذلك ، أضف كميات مختلفة من حمض الهيدروكلوريك إلى 100 ميكرولتر من محلول التحلل في 10 أنابيب مختلفة ، وتحقق من درجة الحموضة للمحلول باستخدام شريط مؤشر الأس الهيدروجيني في نهاية الحضانة بالحجم المناسب من حمض الهيدروكلوريك إلى المحللة واخلطها عن طريق الدوامة. ثم أضف 50 ميكرولترا من ثلاثة × عينة عازلة إلى المحللة واخلطها عن طريق ثقب دوامة ثقب في غطاء أنبوب الفوج الصغير بإبرة وغلي محلول المحللة على كتلة التسخين لمدة خمس دقائق. بعد الغليان ، اترك المحلول يبرد لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بتدوير محلول المحللة وقم بتدويره لمدة 10 ثوان. المحللة جاهزة الآن لتحليل الدم المناعي لإعداد الخلايا لمقايسة الإكتشاف. قم بزراعة ثلاثة مليلتر من كل سلالة كما هو موضح سابقا في اليوم التالي.

تحضير طبقين يحتويان على وسط اصطناعي كامل بدون ليوسين. يجب استكمال وسط أحد الألواح ب 2٪ جلوكوز ووسط اللوحة الأخرى ب 2٪ أكتوز و 1٪ رافينوز. جفف الألواح في شفاط تدفق رقائقي معقم في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

حصاد الخلايا وإعادة تعليق كل حبيبات خلية في ثلاثة ملليلتر من DDW المعقم. كرر خطوة الطرد المركزي وأعد تعليق الخلايا مرة أخرى في ثلاثة ملليلتر من DDW المعقم. حدد الكثافة البصرية أو OD لكل ثقافة ، ثم قم بإعداد معلقات خلية مليلتر واحدة مع OD 600 من واحد في أنابيب ميكروفيش معقمة.

بعد ذلك ، قم بإعداد ثلاثة تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف من كل معلق من معلقات الخلية باستخدام ثلاثة أنابيب دقيقة معقمة مملوءة ب 900 ميكرولتر من DDW المعقم. ضع الألواح الجافة على شبكة ولكل بقعة استزراع ، 10 ميكرولتر من التخفيف الأربعة على التوالي. بعد الإكتشاف ، اترك الألواح مفتوحة في غطاء المحرك لعدة دقائق.

عندما تجف البقع ، قم بتغطية الأطباق وضعها في حاضنة 30 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. الآن سوف نعرض نتائج من اختبار اكتشاف الخميرة للكشف عن تثبيط النمو. الأنماط الظاهرية المستحثة عن التعبير عن المؤثرات من النوع الثالث هنا ، المؤثرات من النوع الثالث ، قفزة A-V-R-P-T-O ، AA واحد و AAV RE واحدة من البكتيريا.

تم التعبير عن مسار Pseudomona Riner للطماطم من سنترومير يحتوي على البلازميد في سلالة الخميرة على سلالات الخميرة المتوسطة التي تحمل البلازميد للتعبير عن A-V-R-P-T-O و HOP AA ، أظهر أحدهما نموا مشابها لسلالة التحكم التي تحتوي على ناقل فارغ. في حين أن الخميرة التي تحمل AAV RE أظهرت نموا منخفضا طفيفا ، ربما بسبب تسرب محفز GAL والسمية الخلوية العالية ل AV RE واحد ، في ظل ظروف محفزة للتعبير عن AV E واحد أو HOP AA واحد تسبب في نمط ظاهري جذري لتثبيط النمو ينعكس على عدم وجود مستعمرات في أي تخفيف. في المقابل ، لم يكن للتعبير عن A-V-R-P-T-O أي تأثير مثبط للنمو.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية تحديد الأنماط الظاهرية لتثبيط النمو الناتجة عن التعبير عن المؤثرات البكتيرية من النوع الثالث في الخميرة. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر اختيار متجه التعبير بعناية بالإضافة إلى هذه السلالة ، لأن كلاهما يمكن أن يؤثر بشكل كبير على النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، تذكر استخدام هذه المستعمرات المحولة حديثا في جميع خطوات الإجراء.

هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.