البلاستيك وتضمينها Sectioning الجنين المورق القيطم

أقسام البلاستيك الحفاظ على النسيج الحقيقي التشكل في الفروع رقيقة من الأنسجة التي يمكن immunostained مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية ، مما يجعل هذا الأسلوب أكثر فائدة من الفروع جزءا لا يتجزأ من البارافين أو المجمدة لكثير من أنواع الأنسجة. ويتجلى أسلوب التلوين ، التضمين من البلاستيك ، وsectioning في هذا الفيديو.

مرحبا ، اسمي سوتشي أوتا. أنا عالم ما بعد الدكتوراه في مختبر الدكتور كين تشو في قسم بيولوجيا النمو والخلية في جامعة كاليفورنيا. إيرف أنا اليوم ، سأريكم إعداد قسم بسيط من جنين xenopus.

يتضمن هذا الإجراء تقسيم تلطيخ جنين الضفدع في المرحلة الغازية المتأخرة بجسم مضاد ضد الجزيء محل الاهتمام ، والتسلل إلى البلاستيك وصنع نفس القسم البلاستيكي بخمسة ميكرون. يمكن استخدام هذا الإجراء لدراسة الكيمياء المناعية التألق المناعي أو التهجين في الموقع مع صورة عالية الدقة جدا. حسنا ، هذه هي الأدوات اليدوية الصغيرة التي أستخدمها لتقسيم البلاستيك الجنيني من 10 جنين زائد.

هذا ملاقط معدني بطرف دلتا وهذا ، رقم واحد ، يمكن استخدامه لتوجيه الجنين بالبلاستيك. وثانيا ، يمكن استخدام هذا مع فرشاة الطلاء هذه لنقل الجنين من الميكروتوم إلى سطح التركيب. هذا عازل مطاطي من السيليكون ، أضعه على سطح الشريحة والذي يقوم بسحب الماء حيث يمكنني تركيب شرائح الأجنة البلاستيكية المقطعة.

الآن أشرح كيفية تقسيم الجنين إلى قسمين ، الجنين الثابت للفحص مثل التهجين المؤسسي أو الكشف عن التألق المناعي. ولقطع نصف الجنين ، أستخدم هذه الشبكة الصحراوية الرقيقة جدا ، والتي يمكنك شراؤها من متجر البقالة. أعتقد نعم ، هناك جنين ثابت يثبت الخلية بنسبة 3.7٪ أعلى رسمي بين عشية وضحاها.

وهذا هو ، تعتمد كيفية إصلاحه على الغرض. تم إصلاح هذا بين عشية وضحاها. لغرض تهجين الشق ، يمكنك الذهاب إلى التثبيت طوال الليل ، ولكن للكشف عن التألق المناعي ، الذي تكتشف فيه البروتين داخل الجنين ، لم أوصي بالتثبيت لفترة طويلة.

وأنا أفضل أن أقوم بتثبيت ارتفاع الشكل بنسبة 3.7٪ لمدة ساعتين فقط لتقليل التأثير على توطين البروتين تحت الخلوي وأيضا تجنب التثبيت الزائد للسماح بالاختراق اللطيف للجسم المضاد أثناء خطوة الكشف. حسنا ، الآن أقوم بتشريح هذا الجنين من خلال جدار الانفجار الذي يقطع الجانب الأيسر والجانب الأيمن. لذا أرى الآن أن هذا يحتوي على جنين المرحلة 11 حيث يكون الفم على طول الطريق من الجانب الظهري إلى الجانب البطني ، ولكن ثنائي الجنين.

ودعونا نلقي نظرة على هذه القطعة اليمنى. ترى الانفجار في كل من الجانب الظهري والجانب البطني ، لكن الجانب الظهري واضح لأن هذا الغزو يصل بوضوح إلى أعمق عمق وعمق داخل الجنين مقارنة بالجانب البطني. لذا فهذه قطعة جيدة ، قطعة جيدة مقسمة لدراسة كل من الجانب الظهري والبطني.

داخل الجنين ، هذا الجنين المفصل ، سأستخدم الكشف عن التألق المناعي للبروتين المعبر عنه داخل الجنين. وبالنسبة للتألق المناعي أو الكيمياء المناعية ، يمكنك استخدام الجسم المضاد الخاص بالأجسام المضادة للكشف. لكن المشكلة هي أن الجسم المضاد لا يخترق جيدا داخل الجنين.

لذلك إذا كنت تستخدم حاملا كاملا ، جنينا شاملا ، فلا يمكنك معرفة ذلك. لا يمكنك دراسة نمط التعبير عن البروتينات في الجنين. ولكن باستخدام هذا الجنين المقسم مسبقا ، يمكنك دراسة نمط التعبير في الخلية في أعماق الجنين.

آه ، تم بالفعل إصلاح الجنين الملطخ بالبقع في 3.7٪ الفورمالديهايد المجفف في الإيثانول وتسلل إلى البلاستيك ، والذي يسمى تكنو 7 ، 100. وتحتوي هذه المجموعة على ثلاثة أجزاء ، وهي هذا الجزء الرئيسي السائل وهذا المسحوق ، والذي يسمى المقسى. وهذا السائل يسمى المقسى الثاني.

أولا ، أخلط هذا الجزء الرئيسي والجزء المقسى مع 100 إلى 1 ريو ، والذي سيمنحك مزيج التسلل هذا. وهذا ما هو ، هذا سائل ، الذي تسللت إليه هذا الجنين. وهذا لا يزال سائلا بحيث لا يتصلب بعد.

وهذه هي تلك العينة الجنينية التي تترك في مزيج التسلل هذا بين عشية وضحاها للتأكد من تلخيص عينة الجنين بالكامل في هذا البلاستيك. الآن آخذ هذا الجنين النموذجي مع ماصة النقل وأنقله إلى أنبوب رقيق الجدار 0.5 MPCL ، والذي أستخدمه كقالب تضمين. ثم من هذا الجنين أزيل السوائل الزائدة.

والآن هذا الجنين ، هذا الجنين جاهز بالفعل ليتم تضمينه في البلاستيك المتصلب. لصنع البلاستيك المتصلب ، يمكنك خلط مزيج التسلل هذا مع هذا الأنبوب المتصلب عند 15 إلى واحد. على سبيل المثال ، إذا أخذت 750 ميكرولتر من مزيج التسلل هذا لدعم الأنبوب ، فمن المفترض أن أضيف 50 ميكرولترا من هذا المقسى أيضا لبدء بلمرة البلاستيك بعد إضافته ، عفوا ، أغلق الغطاء ثم اخلطه برفق مثل هذا.

ويجب ألا تفعل الدوامة لأن الأكسجين هو مثبط تفاعل البلمرة. أضف ما يقرب من 250 ميكرولتر من هذا الخليط إلى الجنين. وتستغرق خطوة البلمرة هذه ما يقرب من أربع ساعات يجب عليك ، ليس عليك الإسراع على الإطلاق.

بعد إضافة هذا البلاستيك البلمرري أولا ، يمكنك الأنابيب لأعلى ولأسفل لصنعه ، وجعل الجنين يطفو في البلاستيك. والآن آخذ هذا الملقط المعدني القابل للدفع حول الجنين لتوجيهه بحيث يأتي سطح القطع للجنين إلى أسفل قالب التضمين هذا. ثم أغلق الغطاء لأن الأكسجين مثبط لتفاعل المعالجة واتركه لمدة أربع ساعات للسماح بتفاعل المعالجة.

بعد ذلك ، هذا قطيع HUD بالفعل في العينة. يمكنك وضع نوع من الغراء على هذه العينة للتأكد من أن هذا الجزء البلاستيكي الصلب لن يخرج من هذا القالب. هذا هو ، هذا بلاستيك آخر يعمل كغراء لهذا الغرض يسمى تكنو 30 40.

وأنا أخلط هذا المسحوق والسائل مع 2 ، 2 ، 1 هنا 0.6 جرام من هذا المسحوق. لذلك سأضيف 300 ميكرولتر من هذا السائل ، ثم أخلطه بسرعة ويصبح هذا البلاستيك صلبا بسرعة كبيرة. إذن هذا جزء ، عليك أن تكون صعبا بعض الشيء ثم تصب هذا على هذه العينة التي سمعت بالفعل.

هذا جيد بما فيه الكفاية. أغلق الغطاء. أبدو هكذا.

وسيستغرق هذا حوالي 30 إلى 60 دقيقة حتى يصبح صعبا. وهذا هو الجاهز للعمل. أولا ، قمت بقص طرف القالب بسكين من الورق المقوى ، وقشر هذا الجزء الطرفي من هذا القالب.

حتى الآن يتعرض هذا الجنين المضمن. وأيضا قمت بقطع هذا الغطاء لأنني لست بحاجة إليه. الآن آخذ إبرة تين روي هذه ، أعني ليس شفرة إبرة روي ، وهي أصعب من شفرة البقع العادية المستخدمة في تقسيم البارين.

أغمس هذا لفترة وجيزة في Xin لجعله نظيفا. اضبط هذا على ، اضبطه على حامل الشفرة وامسح الزين الزائد. وفي بعض الأحيان أقوم بتنظيف هذه المنطقة بزين أيضا لأن نظافة هذه المنطقة مهمة للغاية.

الآن هو جاهز للتقسيم. قبل البدء في التقسيم ، قمت بإعداد غرفة التركيب. إذن هذا هو زجاج المنزلق.

وعلاوة على ذلك ، أضع مطاط السيليكون هذا وأدفع المزارع على طول الطريق حتى لا يكون هناك أي تسرب. ووضع هذا على جهاز تسخين الشريحة وصب هذا الماء النظيف لصنع حمام السباحة الخاص بنا. ووضع أكبر قدر من الماء لتجعلك تحصل عليه حتى تحصل على سطح المياه السطحية.

وهذا مهم لأن سطح مياه الفيضانات هذا يعطي توزيعا متساويا للتوتر السطحي للمياه ، وهو أمر مهم لجعل المقطع يمتد بالتساوي. الآن أقوم بالتقسيم ، لكن قبل القيام بذلك أرتدي هذا القناع لأن كل قطعة من القسم خفيفة جدا وخفيفة جدا ويمكن لثديي أن ينفجر بعيدا عن المسرح. لذلك أرتدي هذا القناع.

والآن ابدأ في التقسيم. بعد أن تحصل على عدد من قطع القسم على المسرح ، تأخذ هذا بفرشاة الطلاء وتتحرك ببطء فوق هذه الغرفة الجبلية وتطرق فرشاة الطلاء هذه لجعل تلك القطعة تدخل الماء عن طريق الجاذبية. وبمجرد أن تهبط على الماء ، فإنها تمتد لتشكل قطعة دائرية على سطح الماء.

كيف يكون هذا الضوء بعد الجفاف طوال الليل. الآن يبدو الأمر هكذا وهذا. الآن العينة جاهزة للاتصال ب DPI للحصول على الحمض النووي.

وبعد ذلك يمكنك الدراسة تحت المجهر. لقد أريتكم اليوم تحضير القسم البلاستيكي باستخدام جنين الضفدع في مرحلة الغاز المتأخرة. هذا الإجراء مفيد جدا لدراسة الخلية الفرعية أو توطين البروتين ، والتي لا يمكن دراستها باستخدام تقنية تضمين الأقواس وأيضا هذا بشكل عام حتى بالنسبة للتهجين المتبقي.

يمنحك هذا القسم البلاستيكي أيضا حتى بالنسبة للتهجين المتبقي ، يمكن أن يمنحك هذا الإجراء مستوى أعلى بكثير من تلك الصورة من عينة المقطع أو المجمدة.