البلاستيك وتضمينها Sectioning الجنين المورق القيطم

مرحباً، اسمي Sochi ota. أنا باحثة في مرحلة ما بعد الدكتوراه في مختبر الدكتور Ken Cho في قسم علم الأحياء النمائي والخلوي في جامعة كاليفورنيا، إيرفين. سأعرض لكم اليوم كيفية تحضير مقاطع بسيطة لجنين xenopus.

يتضمن هذا الإجراء تقسيم جنين ضفدع في مرحلة الغاز المتأخرة إلى نصفين، وتلوينه باستخدام جسم مضاد ضد الجزيء المستهدف، ثم ترسيبه في البلاستيك وعمل مقطع بلاستيكي بسمك خمسة ميكرون. يمكن استخدام هذا الإجراء لدراسة التألق المناعي أو الكيمياء النسيجية المناعية أو التهجين الموضعي بصور ذات دقة عالية جداً. حسناً، هذه هي الأدوات الصغيرة والعملية التي أستخدمها لعمل المقاطع البلاستيكية للأجنة، لعدد 10 أجنة أو أكثر.

هذا ملقط معدني ذو طرف دلتا، وهذا الأول يمكن استخدامه لتوجيه الجنين في البلاستيك. والثاني يمكن استخدامه مع فرشاة التلوين هذه لنقل الجنين من الميكروتوم إلى سطح التثبيت. وهذا عازل من مطاط السيليكون، أقوم بوضعه على سطح الشريحة، وهو ما يشكل تجمعاً مائياً يمكنني من خلاله تثبيت شرائح الأجنة المقطعة في البلاستيك.

سأوضح الآن كيفية تقسيم الجنين إلى نصفين، حيث يكون الجنين مثبتاً من أجل إجراء المقايسات مثل التهجين الموضعي أو الكشف بالفلورة المناعية. ولقص الجنين إلى نصفين، أستخدم هذه الشبكة المعدنية فائقة الدقة، والتي يمكن شراؤها من متاجر البقالة. أعتقد أن الأجنة قد تم تثبيتها باستخدام 3.7% formal high طوال الليل.

وهذا يوضح أن كيفية التثبيت تعتمد على الغرض المنشود. يتم التثبيت هنا طوال الليل. ولغرض التهجين الموضعي، يمكنك إجراء التثبيت طوال الليل، أما بالنسبة للكشف عن التألق المناعي، والذي يُستخدم للكشف عن البروتين داخل الجنين، فلا أنصح بفترة تثبيت طويلة جداً.

وأفضل إجراء تثبيت لارتفاع الشكل بنسبة 3.7% لمدة ساعتين فقط لتقليل التأثير على التموضع تحت الخلوي للبروتين، وكذلك لتجنب التثبيت المفرط للسماح بنفاذ جيد للأجسام المضادة خلال خطوة الكشف. حسنًا، أقوم الآن بتشريح هذا الجنين عبر قطع جدار الكيس من الجانبين الأيسر والأيمن. أرى الآن أن هذا جنين في المرحلة 11 حيث يمتد الـ PO من الجانب الظهري إلى الجانب البطني، ولكنه جنين ثنائي.

ولنلقِ نظرة على هذه القطعة الموجودة على اليمين. يمكنك رؤية الـ blastopore في كل من الجانب الظهري والجانب البطني، ولكن الجانب الظهري واضح لأن هذا الانغماد يصل بوضوح إلى أعمق نقطة داخل الجنين مقارنة بالجانب البطني. لذا، فإن هذه القطعة جيدة، وهي قطعة مقسومة جيداً لدراسة كل من الجانبين الظهري والبطني.

سأستخدم تقنية الكشف المناعي الفلوري للكشف عن البروتين المُعبَّر عنه داخل هذا الجنين الذي تم تشريحه. وفيما يخص التألق المناعي أو الكيمياء النسيجية المناعية، يتم استخدام أجسام مضادة متخصصة لعملية الكشف. ولكن المشكلة تكمن في أن الأجسام المضادة لا تنفذ بشكل جيد إلى داخل الجنين.

لذا، إذا استخدمت الجنين كاملاً في عملية التثبيت (whole mount)، فلن تتمكن من معرفة ذلك، ولن تستطيع دراسة نمط تعبير البروتينات في الجنين. ولكن باستخدام هذا الجنين المقطوع مسبقاً، يمكنك دراسة نمط التعبير في الخلايا الموجودة في عمق الجنين.

لقد تم بالفعل تثبيت الجنين المصبوغ في 3.7% Formaldehyde، وتجفيفه في الإيثانول، ثم تغلغله في البلاستيك، وهو ما يسمى techno 7, 100. وتحتوي هذه المجموعة على ثلاثة أجزاء: هذا الجزء السائل الرئيسي، وهذا المسحوق الذي يسمى المصلب 1، وهذا السائل الذي يسمى المصلب 2.

أقوم أولاً بخلط هذا الجزء الرئيسي والمصلب بنسبة 100 إلى 1، وهو ما سيعطي مزيج التسلل هذا. وهذا المزيج عبارة عن سائل، والذي سأقوم بتسليل هذا الجنين فيه. ولا يزال هذا المزيج سائلاً لذا لن يتصلب بعد.

تُترك عينات الأجنة هذه في مزيج التسلل طوال الليل للتأكد من تشرب عينات الأجنة بالكامل بهذا البلاستيك. الآن، أقوم بأخذ إحدى عينات الأجنة باستخدام ماصة نقل ونقلها إلى أنبوب 0.5 MPCL رقيق الجدار، والذي أستخدمه كقالب للتضمين. بعد ذلك، أقوم بإزالة السائل الزائد من هذه الجنينة.

والآن أصبح هذا الجنين جاهزاً ليتم تضمينه في البلاستيك المصلد. لتحضير البلاستيك المصلد، يتم خلط خليط التسلل هذا مع أنبوب المصلد بنسبة 15 إلى 1. فعلى سبيل المثال، إذا أخذت 750 µL من خليط التسلل في أنبوب، فمن المفترض إضافة 50 µL من المصلد لبدء بلمرة البلاستيك؛ وبعد إضافته، نغلق الغطاء ثم نخلط بلطف على هذا النحو.

ويجب عدم استخدام جهاز الرج (vortex) لأن الأكسجين يعمل كمثبط لتفاعل البلمرة. أضف ٢٥٠ µL تقريبًا من هذا الخليط إلى الجنين. وتستغرق خطوة البلمرة هذه ما يقرب من أربع ساعات، لذا لا داعي للعجلة على الإطلاق.

بعد إضافة هذا البلاستيك المبلمر أولاً، يمكنك تحريكه للأعلى والأسفل لجعل الجنين يطفو في البلاستيك. والآن أستخدم هذه الملقط المعدني لدفع الجنين وتوجيهه بحيث يصبح سطح القطع في الجنين في قاع قالب التضمين هذا. ثم أغلق الغطاء لأن الأكسجين يعمل كمثبط لتفاعل المعالجة، وأتركه لمدة أربع ساعات للسماح بتفاعل البلمرة.

بعد ذلك، هذا هو HUD الذي تم وضعه مسبقاً في العينة. يتم وضع نوع من الغراء على هذه العينة للتأكد من أن هذا الجزء البلاستيكي الصلب لن يخرج من هذا القالب. هذا بلاستيك آخر يعمل كغراء لهذا الغرض ويسمى techno 30 40.

وأقوم بخلط هذا المسحوق والسائل بنسبة 2، 2، 1؛ حيث يوجد هنا 0.6 gram من هذا المسحوق. لذا سأضيف 300 µL من هذا السائل، ثم أقوم بمزجه بسرعة، ويصبح هذا البلاستيك صلباً بسرعة كبيرة. لذا فإن هذا جزء يجب أن تكون سريعاً في التعامل معه، ثم صب هذا فوق العينة المتصلبة مسبقاً.

هذا كافٍ. أغلق الغطاء. يبدو الأمر على هذا النحو.

وسيستغرق ذلك ما يقرب من 30 إلى 60 دقيقة حتى يتصلب. وهذا هو القالب الذي أصبح جاهزاً للتنفيذ. أولاً، أقوم بقطع طرف القالب باستخدام سكين كرتون، ثم أقشر هذا الجزء الطرفي من القالب.

لقد أصبحت الأجنة المدمجة الآن مكشوفة. كما قمت بقص هذه القبعة لأنني لست بحاجة إليها. الآن سأستخدم شفرة Tain Roy، وأقصد شفرة Tain Roy وليس إبرة، وهي أكثر صلابة من شفرة stain العادية المستخدمة في تقطيع العينات.

أقوم بغمس هذا سريعاً في مادة Xylenes لتنظيفه. ثم أثبته في حامل الشفرة وأمسح مادة Xylenes الزائدة. وأقوم أحياناً بتنظيف هذه المنطقة بمادة Xylenes أيضاً لأن نظافة هذه المنطقة أمر بالغ الأهمية.

الآن أصبحت العينة جاهزة للتقطيع. وقبل البدء في عملية التقطيع، أقوم بتجهيز غرفة التثبيت. هذه هي الشريحة الزجاجية.

وبالإضافة إلى ذلك، أقوم بوضع مطاط السيليكون هذا والضغط عليه جيداً في جميع الاتجاهات لضمان عدم حدوث أي تسرب. ثم أضع هذا على مسخن الشرائح وأصب ماء dD H2O النظيف لإنشاء الحوض، مع إضافة كمية كافية من الماء حتى يغمر السطح بالكامل.

وهذا أمر مهم لأن سطح مياه الغمر هذا يضمن توزيعاً متساوياً للتوتر السطحي للماء، وهو أمر ضروري لجعل القطاعات تتمدد بشكل متساوٍ. سأقوم الآن بعمل القطاعات، ولكن قبل ذلك أرتدي هذا القناع لأن كل قطعة من القطاعات خفيفة جداً، وخفيفة لدرجة أن أنفاسي قد تؤدي إلى تطايرها من فوق المنصة. لذا، أرتدي هذا القناع.

والآن نبدأ بعملية التقطيع. بعد الحصول على عدد من القطع العرضية على المنصة، يتم التقاط هذه القطع باستخدام فرشاة رسم ونقلها ببطء إلى أعلى غرفة الحجرة، ثم النقر بالفرشاة لجعل تلك القطع تسقط في الماء بفعل الجاذبية. وبمجرد استقرارها على سطح الماء، تتمدد لتشكل قطعة دائرية على السطح.

كيف يبدو الضوء بعد التجفيف طوال الليل؟ الآن يبدو بهذا الشكل وبهذا الشكل. الآن أصبحت العينة جاهزة للتفاعل مع DPI للحصول على الحمض النووي النووي.

وبعد ذلك، يمكنك إجراء الفحص تحت المجهر. لقد عرضتُ لكم اليوم طريقة تحضير المقاطع البلاستيكية باستخدام جنين ضفدع في مرحلة غازية متأخرة. وتعد هذه الإجراءات مفيدة للغاية لدراسة التراكيب تحت الخلوية أو تحديد مواقع البروتينات التي لا يمكن دراستها باستخدام تقنية الطمر في البارافين، كما أنها مفيدة بشكل عام حتى في عمليات التهجين الموضعي.

كما يتيح لك هذا المقطع البلاستيكي إمكانية إجراء التهجين المتبقي، حيث يمكن أن توفر هذه العملية صوراً ذات مستوى دقة أعلى بكثير من عينات المقاطع الشمعية أو المقاطع المجمدة.