إعداد Oligomeric β اميلويد _1-42 والتعريفي للعاهة اللدونة متشابك على شرائح الحصين

يتم إعادة تعليق بيتا أميلويد 1 42 الاصطناعي في HFIP لعمل مونويمر للببتيد أولاً، ثم يتم تركيزه لاحقاً ليصبح في شكل غشاء من أجل عملية الـ ligamentization. يتم بعد ذلك إعادة تعليق الغشاء في DMSO، وتخفيفه في محلول فوسفات منظم، وتحضينه طوال الليل. وفي النهاية، يتم تخفيف ببتيد الأوليغومر باستخدام محلول التسجيل وعمل تروية له على شرائح حادة من الحصين، حيث يتم تقييم تأثير التعرض لبيتا أميلويد على اللدونة المشبكية.

مرحباً بكم في مختبر آفيو أوريو في جامعة كولومبيا بمدينة نيويورك. مرحباً، سنعرض لكم اليوم إجراءً قمنا بتحسينه لتحضير amyloid beta المكون من 42 حمضاً أمينياً، وهو إجراء يعتمد على بروتوكول اقترحه شتاين وزملاؤه في عام 2003. استخدمنا هذا الإجراء في هذا المختبر لدراسة الخلل الوظيفي التشابكي الناتج عن amyloid beta.

لنبدأ الآن. اترك القارورة التي تحتوي على مسحوق beta amyloid المجفف بالتجميد لتصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، وذلك لتجنب التكثف عند فتحها تحت خزانة استخلاص الغازات. افتح القارورة وأضف HFIP المبرد بالثلج للحصول على تركيز نهائي من beta amyloid يبلغ 1 millimolar.

أغلق القارورة واستخدم جهاز الرج الميكانيكي (vortex) للمزج، ثم قم بتقسيم المحلول بسرعة وبشكل متساوٍ بين ثلاثة أنابيب طرد مركزي دقيقة من مادة البولي بروبيلين منخفضة الارتباط باستخدام حقنة Hamilton. أغلق الأنابيب واتركها للحضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة للسماح للببتيد بالامتزاج، ثم افتح الأنابيب وضعها في جهاز التركيز بالتفريغ (speed vac) لتركيز المحلول. قم بالتدوير عند 800 Gs تحت التفريغ لمدة 15 دقيقة تقريباً.

تأكد من عدم ارتفاع درجة الحرارة عن 25 °C لتجنب تحلل البروتين. تنتهي عملية الطرد المركزي عند ظهور غشاء ببتيدي جاف وشفاف في قاع الأنبوب. قد يصعب رؤية الغشاء، لذا قم بإغلاق الأنابيب بإحكام وتخزين الحصص غير المستخدمة عند -80 °C لمدة تصل إلى ستة أشهر في غطاء التدفق الصفحي. استخدم DMSO لإعادة تعليق الغشاء الببتيدي للوصول إلى تركيز نهائي قدره 5 mM، ثم قم بإجراء المعالجة بالموجات فوق الصوتية في حمام مائي لمدة 10 دقائق.

لضمان تعليق كامل للببتيد، قم بتخزين حصص بمقدار 1.6 µL من محلول beta amyloid بتركيز 5 mM عند درجة حرارة -20 °C. يجب إذابة كل حصة مرة واحدة فقط؛ وفي اليوم السابق للتجربة، قم بإذابة حصة واحدة من محلول beta amyloid بتركيز 5 mM وأضف 98.4 µL من محلول الفوسفات المنظم المعقم ليصل الحجم النهائي إلى 100 µL، ثم استخدم جهاز الـ vortex لمدة 30 ثانية واحضن المحلول عند درجة حرارة 4 °C لمدة 12 ساعة. للسماح ببدء عملية التجمع (ligamentization) قبل بدء التجربة، يتم تحضين محلول تحلل الحصين (hippocampal lysis) الطازج لمدة 90 دقيقة.

في محلول التسجيل القياسي، يتم وضع قطب التحفيز على تفريعات شيفير (shafer's collaterals) ووضع قطب التسجيل على الطبقة الشعاعية (stratum radium). بمجرد العثور على الاستجابة واستقرار الخط القاعدي لمدة 10 دقائق، يتم تخفيف beta amyloid إلى 200 nM. نظرًا لأن beta amyloid يرتبط بشكل غير محدد بالزجاج في محلول التسجيل، لذا يجب استخدام البلاستيك قدر الإمكان.

قم بتروية شرائح الأنسجة بمحلول بيتا أميلويد لمدة 20 دقيقة. قم بإجراء تحفيز toan X المفضل لديك؛ على سبيل المثال، تحفيز theta burst مباشرة بعد التكزز، ثم عد إلى التروية باستخدام محلول تسجيل طبيعي.

راقب التسجيل لمدة ساعتين على الأقل بعد عملية التكزز (tetanus) للتأكد من تحفيز الـ LTP ورؤية آثار العلاج بـ beta amyloid. لقد عرضنا لك للتو كيفية تحضير beta amyloid قليلي القسيمات (oligomeric) من 1 إلى 42 لتحفيز ضعف اللدونة المشبكية في شرائح الحصين. عند إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر أن التجفيف المفرط لغشاء الببتيد قد يؤدي إلى عملية aggregation غير مكتملة.

من الضروري أيضاً استخدام البلاستيك لمحاليل beta amyloid لمنع الارتباط غير النوعي للببتيد. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.