ثنائي الفوتون المستندة إلى تنشيط ضوئي في الأجنة الحية اسماك الزرد

الهدف العام من التجربة التالية هو التنشيط الضوئي لعامل استجابة ضوئية معين، مثل صبغة فلورية مقيدة كيميائياً، في جنين سمكة الزيبرا الحي بدقة الخلية الواحدة. ويتم تحقيق ذلك عن طريق حقن عامل الاستجابة الضوئية في أجنة في مرحلة الخلية الواحدة التي تعبر عن علامة جينية حية لتحديد واستهداف أي خلايا ذات أهمية بدقة. وكخطوة ثانية، يتم تنمية الأجنة وتثبيتها في هلام (agarose) منخفض درجة الانصهار، مما يعمل على تثبيت الجنين الحي.

بعد ذلك، يُستخدم المجهر ثنائي الفوتون لتحديد موقع علامة وراثية فلورية مرئية. ثم يتم تنشيط العامل المستجيب للضوء في المستوى البؤري المطلوب، وتتم مراقبة مدى التنشيط الضوئي. ويمكن بعد ذلك تتبع مصير الخلايا الموسومة الناتجة في مراحل جنينية لاحقة.

يمكن استخدام هذا الإجراء لتنشيط مجموعة متنوعة من المركبات بدقة الخلية الواحدة في العينات الحية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل المجهر البؤري أو المصباح الومضي، في أنها تسمح بالتنشيط الضوئي للأنسجة العميقة نسبياً عند مستوى محوري يبلغ بضع ميكرونات مع سميّة ضوئية منخفضة نسبياً. غير أن الطريقة المعروضة هنا تُستخدم لتتبع حواف الخطوط الوسطية، ويمكن تطبيقها للتنشيط الضوئي لمجموعة متنوعة من المكونات، مما يتيح تحكماً مستهدفاً في العمليات التنموية والفسيولوجية. في المساء الذي يسبق عملية الحقن، قم بتجهيز أحواض التزاوج وافصل ذكور وإناث سمك الزيبرا من سلالة معدلة وراثياً تعبر عن علامة فلورية مرئية.

في هذه التجربة، يُعبّر الخط المعدل وراثياً عن GFP تحت تحكم محفز neurogenic N one. قم بإذابة جزء من الفلوريسين المتقيد المقترن بـ 5% dextran في 0.2 مولار من كلوريد البوتاسيوم على الثلج. خفف الفلوريسين المتقيد في 0.2 مولار من كلوريد البوتاسيوم للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1%. احتفظ بالفلوريسين على الثلج وقم بحمايته من الضوء. اسمح لعمليات تهجين أسماك الزيبرا بالتزاوج، واجمع البيوض المخصبة فور وضعها واغسلها كما هو موضح في النص. استخدم ماصة بلاستيكية لنقل الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة إلى طبق حقن 1% agar مغطى بوسط E3 طازج تحت مجهر تشريحي.

استخدم الماصة لتوجيه الأجنة في أحواض الحقن. اكسر طرف إبرة حقن شعيرية تم سحبها لتكون ذات مستدق طويل. استخدم طرف محمل دقيق لملء الإبرة من الخلف بنحو 1 µL من الـ 1% caged fluorescein.

ضع الإبرة المحملة في مِناور دقيق (microm manipulator) متصل بحاقن دقيق يعمل بضغط الهواء. احقن كل جنين بمقدار 2 إلى 3 nanoliters من الفلورسين المقيد (caged fluorescein) مباشرة في سيتوبلازم الخلية. احقن 50 جنيناً على الأقل في كل تجربة.

انقل الأجنة المحقونة إلى طبق بتري يحتوي على وسط E three طازج واحفظها في الظلام عند درجة حرارة 28.5 °C حتى تصل إلى المرحلة التطورية المطلوبة؛ ولتثبيط التصبغ، أضف Phenyl threa بتركيز 0.1% إلى الأجنة عند مرور 24 ساعة للتحضير لعملية تثبيت الأجنة. قم بتغطية 15 إلى 20 طبق بتري بقطر 60 مليمتر بطبقة رقيقة من 1% Aros المذاب في وسط E two طازج، وعندما يتصلب الـ aros، املأ الطبق بوسط E two تحت مجهر تشريحي.

استخدم ملاقط حادة لوضع الأجنة المحقونة على الأطباق المطلية. تجنب تعريض الأجنة للهواء. احتفظ بجزء من agarose بنسبة 2% منخفض درجة الانصهار في الماء.

في كتلة تسخين عند درجة حرارة 72 °C. استخدم ماصة باست مصقولة بالنار لنقل جنين واحد مغلف في 150 µL تقريباً من الوسط إلى طبق بتري بقطر 60 mm. ضع حجماً مماثلاً من 2% Agros بجانب الجنين واخلط القطرتين معاً بسرعة للحصول على قطرة متجانسة من 1% Agros.

قم بتوجيه الجنين بحيث يكون جانبه الظهري مواجهاً للعدسة الشيئية. اترك الأجار ليتصلب، ثم اغمر الجنين المضمن في وسط E2. ضع الجنين المثبت حديثاً على حامل الشرائح تحت مجهر ثنائي الفوتون مجهز بليزر دوّار عريض النطاق.

قبل البدء في عملية التنشيط الضوئي، قم بالتقاط سلسلة صور من الحافة البطنية إلى الحافة الظهرية للأنسجة المُعبرة عند 860 نانومتر ومسافة. يجب أن تفصل بين الصور ست ميكرونات على المستوى Z. اختر المستوى Z المستهدف للتنشيط الضوئي وقم بضبط التركيز عليه باستخدام GFP كعلامة إرشادية.

حدد المنطقة المراد دراستها. التقط صورة واحدة عند 860 nanometers وأبقِها مفتوحة في نافذة منفصلة لضمان المحاذاة الصحيحة. من الضروري أن يكون الليزر عند 720 nanometers في حالة القفل النمطي (mode locked state) قبل فتح قائمة تحرير التبييض (edit bleach menu).

استخدم الصورة التي تم التقاطها عند 860 nanometers لتحديد المنطقة المستهدفة أو ROI للتنشيط الضوئي. في نافذة تحرير التبييض (edit bleach)، اضبط القيمة النسبية لقوة الليزر وعدد التكرارات وسرعة المسح. ولإجراء التنشيط الضوئي، اضغط على bleach بعد توقف الليزر، ثم عد إلى 860 nanometers والتقط صورة لمستوى واحد لتقييم شدة المادة التي تم تنشيطها ضوئياً.

قم بجمع مجموعة من الصور المتتالية (image stack) لتقييم سمك النطاق المنشط (zsan). وبهذه الطريقة، يمكن تحديد كثافة الليزر ومدة التعرض تجريبياً. ولتحقيق التنشيط الضوئي الأمثل لكل مستنسخ أو صورة ضوئية متقاطعة، قم بتنشيط جميع الأجنة المتبقية للتجربة.

باستخدام هذه الظروف، يتم تربية الأجنة المُثبّتة والمُنشطة ضوئياً في الظلام عند درجة حرارة 28.5 درجة مئوية في وسط E2 الذي يحتوي على 0.1% Phenyl thio urea حتى تصل إلى المرحلة التطورية المطلوبة. وباستخدام مجهر تشريحي، استخدم مشرطاً مدبباً لعمل ثلم على شكل حرف V في الغشاء المحيط بالجنين (aros) بالقرب من الجنين المُثبّت، بحيث تكون قاعدة الثلم موجهة نحو رأس الجنين. ثم ضع مجموعة من الملاقط المغلقة عند نقطة الثلم.

افتح الملقط برفق لفصل الأغشية على طول الجنين وتحريره في الوسط. بعد تحرير كل جنين، استخدم ماصة باستور مصقولة بالنار لجمعه في أنبوب طرد مركزي دقيق. في خزانة استخلاص كيميائية، قم بتثبيت الأجنة باستخدام 4%formaldehyde لمدة ثلاث ساعات.

في درجة حرارة الغرفة، ابدأ بعمليات التجفيف، ثم إعادة الترطيب، والصبغ باستخدام الفوسفاتاز القلوي (alkaline phosphatase) المقترن بـ anti fluorescein، مع إجراء جميع عمليات الغسل المرتبطة بها كما هو موضح في النص المرفق. أضف 500 µL من محلول fast red المُرشح إلى الأجنة. تُحضن الأجنة في الظلام في درجة حرارة الغرفة، مع تجديد محلول صبغة fast red كل ساعة حتى يتم الوصول إلى نسبة الإشارة إلى الخلفية المطلوبة.

أوقف تفاعل الصبغ بثلاث غسلات في PBST لمدة خمس دقائق لكل غسلة. داخل خزانة استخلاص الأدخنة، قم بتثبيت الصبغة في 4%formaldehyde لمدة 20 دقيقة. اغسل مرتين في PBST لمدة خمس دقائق لكل غسلة.

اغسل الأجنة الشفافة من خلال سلسلة من تدرجات الجلسرول بنسب 25% و50% و75% في محلول PBS حتى يستقر كل جنين في قاع الأنبوب. خزن الأجنة عند درجة حرارة 4 °C حتى تصبح جاهزة للفحص المجهري. ولتثبيت الأجنة من أجل المعاينة، استخدم حقنة سعة 1 mL لوضع أربع نقاط من الشحم السيليكوني الشفاف بحجم 20 µL على شريحة مجهرية عند زوايا شكل مربع بطول ضلع 15 mm.

ضع جنيناً في 200 µL تقريباً من الجلسرول بتركيز 75% بين قطرات الشحم. ضع غطاء الشريحة فوق الجنين. اضغط بلطف على غطاء الشريحة إلى الأسفل مباشرة حتى يمتلئ محلول الجلسرول.

يمكن تخزين الأجنة المثبتة في قطرات الشحم في الفراغ الموجود بين القطرات لعدة أيام في درجة حرارة 4 °C قبل فحصها باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy). تُظهر هذه الصورة جنيناً حياً لسمكة الزيبرا يعبر عن GFP تحت تحكم محفز neurogenin 1، والذي تم حقنه بصبغة تتبع الفلوريسين المقيدة (caged fluorescein tracer dye) في مرحلة الخلية الواحدة باستخدام الطريقة السابقة في مرحلة 3 إلى 5 somite.

تم تنشيط منطقة محددة من الدماغ البدائي في الأجنة ضوئياً باستخدام ليزر ثنائي الفوتون، مما سمح بالكشف عن صبغة التتبع الفلورسين التي تم تحريرها. وعقب إجراء التنشيط الضوئي، تم تحضين الجنين عند درجة حرارة 28.5 °C، ثم تتبع الخلايا الدماغية التي تحتوي على الفلورسين المحرر بواسطة صبغ مناعي مضاد للفلورسين باللون الأحمر بعد 24 ساعة من الإخصاب. يلاحظ وجود عدد صغير من الخلايا الملونة. وبمجرد إتقان هذا الإجراء، يمكن تنفيذ عملية التنشيط الضوئي في غضون ساعات قليلة فقط. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر ضبط المعايير المثلى، مما يتيح تنشيطاً ضوئياً دقيقاً بدقة الخلية الواحدة.