قياس يكمل 50 ٪ الدم الانحلالي (CH ₅₀) نشاط المصل

قياس نشاط المتممة الحالة للدم بنسبة 50% (CH 50) في المصل. ستحتاج إلى ماصة قادرة على سحب 200 µL وأخرى قادرة على سحب 1000 µL، ومصل اختبار تم تخزينه على الثلج، وكريات دم حمراء من أغنام محسسة، ومحلول ملحي منظم فواروني، وماء مقطر، وأنابيب للمصل المختبر، وأنابيب للقياس المرجعي والتحلل الكامل، وجهاز مزج دوامي (vortex mixer)، وصفيحة ذات 96 بئراً ذات قاع مسطح. قم بتسمية الأنابيب بشكل فردي بكلمة "الضابطة" والتخفيف النهائي؛ وفي هذه الحالة، نبدأ بتخفيف بنسبة 1 إلى 8.

استمر في إجراء التخفيف المضاعف للحصول على تخفيفات بنسبة 1 إلى 16، و1 إلى 32، و1 إلى 64، و1 إلى 128، مع تسمية الأنابيب المتبقية بـ "blank" و"total lysis". وبمجرد الانتهاء من تسمية جميع الأنابيب، يمكنك الآن البدء في تخفيف المصل المراد اختباره. ابدأ بنقل 300 µL من محلول R buffer saline إلى أنبوب جديد.

قم الآن بنقل 100 µL من المصل إلى 300 µL من المحلول الملحي المنظم R. سيعطيك هذا تخفيفاً أولياً بنسبة واحد إلى أربعة. تأكد من خلط عينة المصل جيداً.

قم الآن بنقل 200 µL من المحلول الملحي المنظم (PBS) إلى الأنابيب التي تم تمييزها مسبقاً. كذلك، أضف 200 µL من المحلول الملحي المنظم إلى أنبوبي التحكم الفارغين ضمن أنابيب التحلل الكلية. أضف 200 µL من الماء المقطر، وليس المحلول الملحي المنظم.

انقل الآن 200 µL من المصل المخفف بنسبة 1 إلى 4 إلى الأنبوب المسمى 1 إلى 8. لقد قمنا سابقاً بنقل 200 µL من المحلول الملحي المنظم الفوسفاتي إلى سلسلة الأنابيب من 1 إلى 8 وحتى 1 إلى 128. سيؤدي هذا الآن إلى الحصول على تخفيف بنسبة 1 إلى 8.

امزج العينة جيداً، ثم انقل 200 µL إلى الأنبوب المسمى "واحد" في الخطوة 16. استمر في هذه العملية حتى يتم تخفيف السلسلة الكاملة من الأنابيب. تخلص من 200 µL من الأنبوب ذو التخفيف 1:28 بحيث يكون الحجم النهائي 200 µL.

قد تترسب خلايا الدم الحمراء للأغنام المحسسة بمرور الوقت. سيتطلب ذلك إعادة تعليقها عن طريق قلب الأنبوب برفق عدة مرات. وبمجرد إعادة التعليق جيداً، يتم نقل 200 µL من خلايا الدم الحمراء للأغنام المحسسة إلى كل أنبوب من الأنابيب المُحضرة.

تأكد من خلط المصل جيداً مع خلايا الدم الحمراء. إن إضافة خلايا الدم الحمراء للأغنام المُحسسة إلى الأنبوب الفارغ ستسمح لك بتحديد التحلل التلقائي، بينما تسمح إضافة الدم إلى أنبوب التحلل الكلي بتحديد قيمة 100%؛ باستخدام جهاز مزج دوامي (vortex mixer) مضبوط على درجة منخفضة، اخلط كل أنبوب برفق. الآن، ضع الأنابيب في حمام مائي عند درجة حرارة 37 degrees Celsius واتركها لتحضن لمدة 30 دقيقة.

بعد 15 minutes من التحضين، قم برج الأنابيب برفق باستخدام جهاز vortex مرة أخرى، ثم حضنها لمدة 15 minutes إضافية. بعد التحضين، انقل الأنابيب إلى جهاز طرد مركزي مضبوط على أربع degrees Celsius، وقم بالطرد المركزي عند 1500 G لمدة five minutes. بعد الطرد المركزي، أخرج الأنابيب بعناية وضعها في حامل مناسب. ستلاحظ هنا وجود راسب من خلايا الدم الحمراء بينما يظهر الـ SNA باللون الأحمر.

نظراً لإطلاق انتقال الهيموجلوبين، يتم إضافة 100 µL من الماء المقطر في العدد المطلوب من آبار صفيحة ذات قاع مسطح تحتوي على 96 بئراً. مع الحرص على تجنب نقل الراسب، يتم نقل 100 µL من السائل الطافي إلى بئر مناسب في صفيحة الـ 96 بئراً. وبمجرد تحميل جميع العينات في الصفيحة، يتم قياس الامتصاص باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأطباق المضبط عند 540 nm.

لدينا هنا بيانات الامتصاص الخام للتكرارين، A1 و B1. يرجى الرجوع إلى التخفيف بنسبة 1:8.

بعد ذلك، لدينا البيانات الخاصة بالتخفيفات 1 في 16، و1 في 32، و1 في 64، و1 في 128. وتمثل العينات A6 وB6 العينة الضابطة (البلانك)، بينما تمثل A7 وB7 التحلل الكلي.

بمجرد جمع البيانات، يجب حساب متوسط الامتصاص لكل عينة مكررة. بعد ذلك، يتم طرح امتصاص العينة الضابطة (Blank)، والذي يمثل التحلل التلقائي، من جميع العينات. وبمجرد جمع كافة البيانات، يمكنك الآن حساب النسبة المئوية للتحلل لكل تخفيف باستخدام الصيغة التالية.

بمجرد حساب جميع البيانات، قم برسم النسبة المئوية للتحلل على المحور الرأسي مقابل تخفيف المصل على المحور الأفقي. ويمكن بعد ذلك استخدام الرسم البياني الناتج لحساب تخفيف المصل المطلوب لإحداث تحلل بنسبة 50% من خلايا الدم المحسسة. يوضح هذا الرسم البياني النسبة المئوية للتحلل مقابل مضاعفات تخفيف المصل.

يمكن بعد ذلك رسم خط من نقطة تحلل 50% حتى يتقاطع مع المنحنى. وعند نقطة التقاطع مع المنحنى، يتم رسم خط رأسي نزولاً إلى المحور الأفقي. تمثل هذه القيمة معامل التخفيف الذي يجب تخفيف المصل إليه لضمان تحلل بنسبة 50%؛ وعند مقارنة عينتين من المصل لتحديد ما إذا كان هناك فرق في CH 50، يمكن استخدام التخفيف الذي يحقق تحللاً بنسبة 50% كمقياس.