التحقيق في الأنسجة والجهاز محددة الردود فيتوكروم باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بمساعدة خلية من نوع التنميط معينة في التعبير thaliana Arabidopsis

لفحص استجابات الفايتوكروم في أنواع محددة من الخلايا النباتية. يتم تهجين خطوط GAL 4G FP enhancer trap و U-A-S-B-V-R المعدلة وراثياً لإنتاج سلالات تعاني من نقص في الفايتوكروم. تُعزل بروتوبلاستات الأوراق من نباتات النسل الناتجة عن تهجين U-A-S-B-V-R مع GA 4G FP.

بعد ذلك، يتم فرز البروتوبلاستات باستخدام تقنية facs لعزل البروتوبلاستات السلبية لـ GFP والبروتوبلاستات الإيجابية لـ GFP في عينات منفصلة، ثم تُحلل البروتوبلاستات المعزولة بواسطة المجهر متحد البؤر بالمسح الليزري. وللتأكيد على جمع البروتوبلاستات الإيجابية لـ GFP، يتم استخلاص RNA من البروتوبلاستات وتحليله طيفياً. مرحباً، أنا Sanka Pivar من مختبر BARDA Montgomery في مختبر أبحاث نباتات الطاقة التابع لجامعة ولاية ميشيغان.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لعزل البروتوبلاست الورقية من نبات Arabidopsis thaliana من أجل فرز الخلايا بمساعدة الفلورة وتحليل التعبير الجيني الخاص بنوع الخلية. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الاستجابات المعتمدة على الفيتوكروم الخاصة بالأنسجة والأعضاء. لذا، دعونا نبدأ.

تم استنتاج سلالة Arabidopsis ANA المستخدمة في هذا الإجراء من خلال منهجية مصيدة المعزز ثنائية الأجزاء. أحد الوالدين من مكتبة سلالات مصيدة المعزز بأنماط تعبير gal مختلفة. كما يعبر الوالد الأول عن GFP تحت تحكم تسلسل التنشيط العلوي أو UAS.

باختصار، يقوم عامل النسخ GA four بتنشيط أي جين يوضع تحت تحكم UAS. في السلالة الأبوية الأولى، يقوم GA four بتنشيط GFP؛ وقد تم تهجين السلالة الأبوية الأولى مع السلالة الأبوية الثانية، وفي السلالة الأبوية الثانية، يخضع جين BVR لتحكم GAL four من خلال UAS.

السلالة الناتجة عن التهجين هي U-A-S-B-V-R cross G 4G FP. في السلالات الأبوية، يسير الاصطناع الحيوي لكروموفور الفيتوكروم من LA عبر الهيم إلى biver الذي يُختصر بـ bv. أما في النسل، فإن ناتج جين BVR يمنع التكوين الحيوي لكروموفور الفيتوكروم عن طريق اختزال السلف BV. وقد تم تأكيد سلالة نسل BVR المصيدة للمعزز هذه، ويمكن استخدامها لفحص كيفية تأثير انخفاض مستويات الفيتوكروم النشط على أنسجة نباتية مختلفة.

ابدأ هذا الإجراء بتجهيز التربة والأواني لزراعة النباتات من أجل إنتاج بروتوبلاستات الأوراق. قم ببذر حوالي 2000 بذرة معقمة لكل عينة في كل تجربة في التربة الموجودة بالأواني. يتم إضافة الماء إلى قاع الصينية التي تحتوي على الأواني، ثم تُغطى الصينية بالكامل بغلاف بلاستيكي.

تُزرع النباتات لمدة خمسة أسابيع تحت إضاءة بيضاء عند درجة حرارة 22 درجة مئوية ورطوبة 70%. بعد مرور أول خمسة إلى ستة أيام، يتم التأكد من إنبات البذور ويُزال الغطاء البلاستيكي عن الصينية. ومن أجل عزل البروتوبلاست، يتم أولاً تحضير محلول TEX المنظم؛ لتحضير لتر واحد من المحلول المنظم، يتم وزن خمسة أملاح من GA's وهي: MES، وكلوريد الكالسيوم، ونترات الأمونيوم، والسكروز.

أذب المكونات تماماً في حوالي 900 مللي لتر من الماء المقطر منزوع الأيونات، والمشار إليه اختصاراً بـ DD H2O، ثم اضبط الأس الهيدروجيني pH إلى 5.7 باستخدام KOH بتركيز مولار واحد. بعد ذلك، أكمل الحجم النهائي إلى لتر واحد وقم بالتعقيم عن طريق الترشيح.

بعد ذلك، اجمع أوراقاً خضراء سليمة من النباتات. اجمع حوالي 250 milliliters من الأوراق المعبأة بشكل فضفاض في دورق. اشطف الأوراق باستخدام 40 milliliters.

يُغسل أربع مرات بـ DD H2O ثم يُشطف مرتين بـ DD H2O معقم باستخدام مشرط رقم 20. تُقطع الأوراق إلى شرائح رفيعة ويُقسم النسيج بالتساوي على أنبوبين بلاستيكيين معقمين سعة 50. يتم تحضير خليط هضم الأوراق بتركيز 1x عن طريق إضافة 5 مليلتر من المحلول المخزون بتركيز 10x، والذي تم تحضيره بإذابة mazy R 10 بنسبة 2% وزن/حجم وcellulase بنسبة 4% وزن/حجم من azua R 10 في TEX buffer، إلى 45 مليلتر من TEX buffer طازج.

أضف حوالي 25 milliliters من محلول هضم الأوراق بتركيز 1x. اخلطه مع شرائح الأوراق في كل أنبوب بحيث يتم تغطية جميع أنسجة الأوراق. انتقل إلى عملية التفريغ الهوائي لترشيح أنسجة الأوراق في محلول الهضم.

امزج المكونات في أنابيب مفتوحة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام مجفف تفريغ متصل بمضخة مياه. حافظ على تغطية أنابيب الغطاء التي تحتوي على أنسجة الأوراق ومزيج هضم الأوراق بورق الألومنيوم لمنع التعرض للضوء. اتبع ذلك بحضانة لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز مع رج لطيف.

بعد ثلاث ساعات، قم بزيادة سرعة الهزاز لمدة دقيقتين لتحرير البروتوبلاستات. قم بترشيح معلق البروتوبلاستات الخام عبر طبقتين من الشاش المعقم لإزالة الحطام، واجمع الرشاحة في بيكر زجاجي معقم. ثم قم بترشيح الرشاحة عبر شبكة نايلون معقمة بقطر مسام 100 micrometer في طبق بتري معقم.

اجمع السائل المتدفق وانقله إلى أنبوب معقم جديد سعة 50 milliliter. استخدم حوالي 15 إلى 20 milliliters من محلول TEX buffer الطازج لغسل طبق بتري المعقم وجمع أي بروتوبلاست ملتصقة بالسطح. قم بطرد السائل المتدفق مركزياً بقوة 100 ×g عند درجة حرارة 10 °C لمدة 15 دقيقة باستخدام جهاز طرد مركزي ذو دلو متأرجح (swing bucket centrifuge)، مع ضبط التسارع على 6 والتباطؤ على 0 عند اكتمال عملية الطرد المركزي.

استخدم ماصة زجاجية معقمة بطول تسع بوصات متصلة بمضخة 연동ية (peristaltic pump) لإزالة حوالي 25 إلى 30 ملليلتر من السائل الموجود أسفل طبقة البروتوبلاست العائمة، والذي يحتوي على الرواسب والحطام المترسب، وذلك دون تعكير طبقة البروتوبلاست العائمة، مع ترك حوالي 10 إلى 50 ملليلتر. بعد إزالة الحطام المترسب، أضف محلول TEX المنظم الطازج حتى يصل الحجم النهائي إلى 40 ملليلتر. وأثناء إعادة تعليق البروتوبلاست بلطف، كرر عملية إزالة الحطام وإعادة تعليق البروتوبلاست العائمة المتبقية.

كرر العملية مرتين إضافيتين لإزالة أكبر قدر ممكن من الحطام الخلوي. يتم تقليل وقت الطرد المركزي إلى 10 minutes في التكرار الأول وإلى five minutes في التكرار النهائي. وأخيرًا، استخدم ماصة نقل معقمة سعة one milliliter لسحب البروتوبلاست العائمة ونقلها إلى أنبوبة جديدة سعة 15 milliliter.

انتقل مباشرة إلى عملية الفرز قبل البدء بالفرز. افحص البروتوبلاستات باستخدام المجهر البؤري الماسح بالليزر أو CLSM باختصار، باستخدام ليزر بطول موجي 488 نانومتر للإثارة للتأكد من سلامة البروتوبلاستات ووجود تألق GFP في تجمع البروتوبلاستات. من الضروري تقليل الحطام الخلوي لتجنب انسداد فوهة الفرز، ثم قم بفرز البروتوبلاستات المعزولة في محلول TEX buffer عبر جهاز الفرز.

باستخدام فوهة بحجم 200 ميكرومتر على رأس فرز عياني (macro sort head) بمعدلات أحداث تتراوح بين 6,000 و 15,000 وبضغط نظام يبلغ حوالي 9 PSI وفقاً لبروتوكول معدل، استخدم بروتوبلاستات النوع البري (wild type) غير الفلورية (non GFP) لتحديد عتبات التألق الذاتي لجمع البروتوبلاستات الموجبة لـ GFP، وذلك بفرز الخلايا باستخدام ليزر أرغون يعمل بقدرة 100 ميلي واط على خط أرغون بطول موجي 488 نانومتر. ولتحديد تألق GFP، يتم استخدام مرشح تمرير نطاق 530/30 بعد جمع البروتوبلاستات الموجبة لـ GFP. ثم افحص البروتوبلاستات المفروزة تحت المجهر كما تم القيام به قبل بدء عملية الفرز لغرض تحليل ملف التعبير (expression profiling).

استخلص الحمض النووي الريبوزي (RNA) الكلي من البروتوبلاستات التي تم فرزها. بعد ذلك يمكن تحضير الـ CDNA لعملية التهجين. ثم يتم إخضاع الـ CD NA للتهجين باستخدام مصفوفات الجينوم الكامل TH one OPSYS Ametri.

فيما يلي بعض النتائج التمثيلية لفرز البروتوبلاست في عينة التحكم من النوع البري. تفتقر البروتوبلاست إلى أي إشارات في بوابة GFP الموجبة. ومع ذلك، تم تحديد إشارات GFP موجبة لعينات البروتوبلاست المعزولة من سلالات GAL 4G FP، بينما تفتقر البروتوبلاست المعزولة من نباتات النوع البري إلى أي فلورة GFP في تحليلات CLSM قبل عملية الفرز.

بينما تم اكتشاف خليط من البروتوبلاست التي تفتقر إلى الفلورية GFP والتي تظهرها في عينات البروتوبلاست من سلالات GAL 4G FP بعد الحقائق. ويشير تحليل CLSM إلى عزل البروتوبلاست الموجبة لـ GFP من سلالة gal 4G FP ممثلة، حيث يمكن استخلاص RNA من البروتوبلاست المعزولة، ويُنتج مليلتر واحد كمية كافية من RNAA للكشف عنها بواسطة الفلورومتر. لقد أظهرنا لكم للتو كيفية عزل بروتوبلاست الأوراق من atopy ANA لفرز الخلايا بمساعدة الفلورية وتحليل التعبير الجيني الخاص بنوع الخلية.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التعامل برفق مع البروتوبلاستات والحد من تعرضها للضوء. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.