Name: الفحص التجريبي الإنبثاث (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-24T17:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: تعلم تقييم القدرة الإنبثاثية لخلايا سرطان بشرية باستخدام حقن الوريد الذيلي في فئران نقص المناعة. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة سلوك الخلايا السرطانية وتطوير استراتيجيات علاجية فعالة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم اختبار هذا البروتوكول وتحسينه في البداية في مختبر الدكتور ريتشارد هينز (MIT). يتم توفير التمويل من جانب NYSTEM جائزة IDEA (لLX) وروث L. كيرشتاين خدمة القومي للبحوث جائزة (لLX).

1. تحضير العينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا لمتموجة ~ 70 ٪ في وسائل الإعلام الخاصة بها مع عوامل النمو أو FBS (على سبيل المثال ، مع DMEM FBS 10 ٪ لMC - 1 الخلايا). نضح من وسائل الاعلام لوحة ، ويغسل بلطف عدة مرات مع PBS × 1 (8 ز / لتر من كلوريد الصوديوم ، 0.2 غرام / لتر من بوكل ، 1.15 جم / لتر من نا 2 4 هبو 0.7 H 2 O ، 0.2 غرام / لتر من KH 2 PO 4 ، ودرجة الحموضة 7.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج تلفزيوني ونضح إضافة 2 مل من التربسين 0.05 ٪ في versene (0.014 غرام / لتر من أحمر الفينول و 0.2 غرام / لتر من EDTA - نا في برنامج تلفزيوني × 1 ، ودرجة الحموضة 7.2). صخرة بلطف لوحة لتسهيل مفرزة الخلية من لوحة. مراقبة الخلايا تحت المجهر. وعادة ما يستغرق 2-5 دقائق للفصل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة وحدة تخزين وافرة من وسائل الإعلام التي تحتوي على FBS (فول الصويا أو مثبط التربسين) لإخماد النشاط التربسين وجمع الخلايا في أنبوب الصقر 50mL. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. تحميل 10μL التعليق الخلية في الصعود إلى عدادة الكريات نظيفة. عدد الخلايا في مل يساوي متوسط ​​عدد الخلايا في كل من المربعات five مضروبا 10 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 1000 دورة في الدقيقة (أو 200 ~ XG) في أجهزة الطرد المركزي الفوق لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية وسائل الاعلام من دون إزعاج بيليه الخلية. Resuspend الخلايا في حجم مناسب من الحل المتوازن الاحتياطي هانكس (HBSS) للوصول إلى التركيز النهائي لل~ 5 × 10 6 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية الخلايا خلال 70 ميكرومتر فالكون مصفاة خلية خلية لاستبعاد المجاميع الكبيرة. مكان غيض من ماصة مباشرة على تصفية أكثر من الأنبوب المسمى 5mL الثقافة فالكون. إخراج بسرعة تعليق من خلال تصفية في أنبوب الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد مرة أخرى باستخدام خلايا عدادة الكريات وتمييع لهم تركيز النهائي من 2.5 × 10 مل / 6. تبقي الخلايا على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الجدوى من الخلايا. خلط بعض الخلايا مع الأزرق التريبان وقياس نسبة الخلايا (الأزرق) الى طريق مسدود بسبب الخلايا مجموع باستخدام عدادة الكريات. ينبغي أن يكون بقاء الخلايا ≥ 90 ٪ قبل الحقن. </li></ol> 2. حقن في الوريد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير القفازات. انتزاع بلطف ذيل ماوس العوز المناعي (عارية ، NOD - SCID ، أو مجموعة موردي المواد النووية ، مختبر جاكسون) ، وتسحبه إلى restrainer الماوس ، مع ظهرها ضد الشق وذيله تخرج من فتحة صغيرة في الجزء الخلفي من restrainer . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريحة ببطء على طول الحلبة الشق الداخلي وقفل مرة واحدة في مكان الحلبة يمسك الفم من الفأرة. ينبغي أن لا يكون الماوس قادرة على التحرك بحرية ، ولكن ينبغي أن يكون المعدل الطبيعي للتنفس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على أوردة الذيل الرئيسية. أربعة الأوعية الدموية الرئيسية موجودة في ذيل الفأر. الأوعية الدموية على جانبي ظهري وبطني من الذيل والشرايين. الأوردة الموجودة على الجانبين الوحشي الذيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعادل أكثر من 200 ميكرولتر من خلايا المعدة إلى حقنة 1mL. إرفاق الإبرة 30 G1 / 2 بوصة ، وطرد أي فقاعات الهواء التي قد تكون موجودة. وينبغي أن الحجم النهائي للخلايا في حقنة سيكون 200 ميكرولتر (أي 5 × 10 5 خلايا في المجموع). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الخلايا في الوريد الذيل. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أبدأ من النهاية البعيدة من الذيل ، حتى إذا فشل في المحاكمة الأولى ، ويمكن استخدام هذه المنطقة القريبة من أكثر الذيل لمحاولة ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح الذيل مع الايثانول 70 ٪. سحب الذيل على التوالي. الاستمرار على طرف الذيل مع الإبهام ودعم للحقن نقطة مع السبابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال الإبرة في الوريد وحقن الخلايا. تأكد من أن الإبر والمحاقن موازية لالوريد خلال الحقن ، وإلا فإن الإبرة كزة من خلال جدار الوعاء الدموي وحقن هذه الخلايا في الأنسجة المجاورة الذيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الإبرة بعد الحقن. وينبغي أن الدم الغزير من موقع الحقن إذا ذهب حقن بنجاح. اضغط قطعة نظيفة من منشفة ورقية أو مسحة القطن في موقع الحقن لتسهيل تخثر الدم ، وجس صعودا الذيل لدفع أي عينة المتبقية في الوريد في التداول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الافراج عن الماوس من restrainer وإعادته إلى القفص. سجل عملية الحقن (على سبيل المثال ، كم عدد التجارب التي اتخذها لحقن الخلايا وإلى أي مدى تم حقن الخلايا) في دفتر المختبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الجدوى من الخلايا بعد الحقن ، كما هو موضح في قسم إعداد العينات ، والخطوة 9. هذه الخطوة توفر الاطمئنان إلى أن خلايا البقاء على قيد الحياة خلال عملية الحقن. في نهاية تجربة الحقن ، فإن بقاء الخلايا الانخفاض ، ولكن ينبغي أن يكون فوق 80 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري) تدور باستمرار على بقايا الخلايا وشطف الكريات مع برنامج تلفزيوني واحد. تجميد -80 درجة مئوية في الكريات لتحليل المستقبل (على سبيل المثال ، للتأكد من البقع الغربي التعبير الجيني أو knockdowns). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عادة بعد شهر أو شهرين ، سيتم تشريح الفئران ، ونحن مصممون على نحو فاضح مواقع الانبثاث. الرئة هو الموقع الرئيسي لورم خبيث ، حيث أنه يحتوي على سرير first الشعرية أن الخلايا اللقاء بعد اندخول الدورة الدموية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الشطف مع برنامج تلفزيوني ، كل فص من الرئة (أو الأنسجة الأخرى التي تحتوي على الانبثاث) لوحظ تحت المجهر تشريح (الشكل 1). يتم احتساب عدد الانبثاث يمكن كشفها في كلا الجانبين من الرئة وتضاف أعداد الانبثاث الرئة على جميع أربعة فصوص معا في العدد الإجمالي للالانبثاث الرئة ويتم الكشف عنها بسهولة أكبر الانبثاث الرئة 1 إذا تم إصلاحها في الرئتين بين عشية وضحاها الفورمالين منذ سوف الانبثاث apppear كبقع بيضاء على النقيض من الظلام المتاخمة أنسجة الرئة البني. </li></ol> 3. زراعة خلايا الرئة من الانبثاث <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معزولون الانبثاث الرئة من الفئران المحقونة. وينبغي لكل مثقف بشكل منفصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو كل مفروم الانبثاث بحلول نهاية قبعة إبرة (معقمة) على مصفاة ميكرومتر الخلية 70. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مصفاة مع خلية تراخيص العديد من الخلايا التي تم جمعها والمتوسطة والتي تمر من خلال مصفاة في صحن الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا على 37 درجة مئوية على الأقل أربعة أيام من دون ازعاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الدم أو الأنسجة الحطام على الطبق مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المتوسطة الطازجة. في البداية ، كل من الخلايا السرطانية والخلايا الليفية تنمو على لوحات ، ولكن تدريجيا ، والخلايا الليفية سوف تنقرض وتحل محلها خلايا السرطان. إذا كانت الخلايا السرطانية تحمل أي جينات مقاومة للأدوية ، وحدد الخلايا التي تحتوي على المضادات الحيوية ذات الصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تقييم نقاء من الخلايا التي يجنيها immunostaining باستخدام أجسام مضادة ضد البشرية محددة البروتينات. نستخدم الأضداد المضادة للvimentin الإنسان (NCL - VIM - V9 ، Novocastra). الخلايا المشتقة نحن تحتوي عادة على أكثر من 99 ٪ من الخلايا البشرية ، حتى في غياب التحديد المخدرات. ويمكن حقن الخلايا المشتقة حديثا مرة أخرى إلى الفئران لاختبار العوز المناعي قدراتهم المتنقل ، كما هو موضح أعلاه. </li></ol> 4. ممثل النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية هذا الاختبار ، وخلية السرطان النقيلي للغاية خط يعطي عادة إلى ظهور العديد من الرئة الانبثاث (الشكل 1) ، 1 في حين الانبثاث الرئة عدد قليل جدا سيأتي من خط خلية السرطان النقيلي سيئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا المشتقة باستخدام هذا الأسلوب عادة ما تعطي ترتفع إلى أكثر من خط الانبثاث الوالدين ، وعندما يتم اختبارها مرة أخرى باستخدام هذا الاختبار. 1-3 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1942/1942fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> صور الممثل الشكل 1. الرئتين الماوس بعد حقن الوريد ذيل الخلايا السرطانية. تم حقن 5 × 10 5 من سرطان الجلد المنتشر الإنسان خط الخلية ، وخلايا SM ، و 4 في الوريد ذيل الفئران العوز المناعي. بعد ذلك بشهرين ، تم عزل الرئتين وعثر الانبثاث فرقت بين أنسجة الرئة العادية.

<ol><li>Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+an+animal+melanoma+model+correlate+with+aggressiveness+of+human+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases.</a> Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).</li>
<li>Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).</li>
<li>Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR56%2C+an+atypical+G+protein-coupled+receptor%2C+binds+tissue+transglutaminase%2C+TG2%2C+and+inhibits+melanoma+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).</li>
<li>Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+melanoma+line+heterogeneous+with+respect+to+metastatic+capacity+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice.</a> J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).</li>
</ol>

الانبثاث هي السبب الرئيسي للوفاة لدى مرضى السرطان. أنها تنطوي على أربع خطوات رئيسية : المفرزة من الخلايا السرطانية من مواضع الأساسي ، دخولهم في التداول (intravasation) ، خروجهم من التداول (التسرب) ، والبقاء والنمو في الجهاز البعيد. يعتبر ورم خبيث في الإنسان عملية بطيئة وتجلت في كثير من الأحيان بعد سنوات من الكمون. لدراسة التقدم في الوقت المناسب ، وقد تم تأسيسها في أعلاه مقايسة تجريبية سريعة نسبيا في الفئران العوز المناعي 4 منذ تأسيسها ، وقد تم استخدامه بشكل فعال لعزل ال...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10313-021</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6838-04</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7896-04</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7100-12</td><td></td></tr><tr><td>أحمر الفينول</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>أزرق التريبان</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>تريبسين 2.5%</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>إيثانول</td><td>Ultrapure</td><td>200-CSGP</td><td></td></tr><tr><td>أنبوب فالكون سعة 50 ml</td><td>VWR international</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب طرد مركزي دقيقة</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>مصفاة خلايا فالكون 70&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>أنبوب زراعة فالكون سعة 5ml</td><td>VWR international</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>مقياس كريات الدم</td><td>Hausser Scientific</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>حقنة سعة 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>329650</td><td></td></tr><tr><td>إبرة مقاس 30 &amp;frac12; gauge</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>مثبت للفئران</td><td>Plas Labs Inc.</td><td>551-BSRR</td><td></td></tr><tr><td>مقص جراحي</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>ملقط</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-902</td><td></td></tr><tr><td>مجهر تشريحي</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي مكتبي</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75003491</td><td></td></tr></tbody></table>

الفحص التجريبي الإنبثاث

Experimental Metastasis Assay

الانبثاث هي السبب الرئيسي للوفاة لدى مرضى السرطان. لفهم آلية من ورم خبيث ، أنشئت لفحص الانبثاث تجريبية باستخدام الفئران العوز المناعي. هذه المادة يحدد الإجراءات التي ينطوي عليها هذا الاختبار ، بما في ذلك إعداد العينات ، والحقن في الوريد ، واستنبات الخلايا من الانبثاث الرئة. لفترة وجيزة ، تم إعداد عدد محدد مسبقا من الخلايا السرطانية البشرية<em&gt; في المختبر</em&gt; وحقنه مباشرة في الدورة الدموية للفئران العوز المناعي عن طريق الأوردة ذيلها. وهناك عدد قليل من الخلايا تنجو من اضطرابات في الدورة الدموية وتنمو الانبثاث في الأعضاء الداخلية ، مثل الرئة. يتم تشريح الفئران حقن بعد فترة معينة. يتحدد توزيع الأنسجة الانبثاث تشريح تحت المجهر. يتم احتساب عدد الانبثاث في نسيج معين وأنه يرتبط بشكل مباشر مع القدرة النقيلي من حقن الخلايا السرطانية. يتم عزل الانبثاث نشأت ومثقف<em&gt; في المختبر</em&gt; كخطوط الخلية ، والتي غالبا ما تظهر قدرات محسنة النقيلي من خط الوالدين عندما تم حقنها في الفئران مرة أخرى العوز المناعي. هذه المشتقات المنتشر بشدة تصبح أدوات مفيدة لتحديد الجينات الجزيئية أو المسارات التي تنظم التقدم النقيلي.

توضح هذه المقالة الإجراءات لفحص الانبثاث التجريبية التي تستخدم لتحديد إمكانية النقيلي من خطوط الخلايا السرطانية البشرية.

تُعد النقيلة السبب الرئيسي للوفاة لدى مرضى السرطان. وفهمًا لآلية حدوث النقيلة، تم إنشاء مقايسة تجريبية للنقيلة...

الهدف العام من التجربة التالية هو اختبار القدرات النقيلية للخلايا السرطانية البشرية عن طريق الحقن في الوريد الذيلي. يتم تحضير الخلايا للحقن في فئران تعاني من نقص المناعة، ثم تُحقن هذه الخلايا في تلك الفئران، والتي ستُظهر نقائل رئوية بعد شهر واحد إلى شهرين.يتم تشريح الفئران وقياس النقائل الرئوية واستزراعها. وتشير نتائج هذا النوع من المقايسات إلى مدى انتشار النقائل لنوع معين من الخلايا السرطانية. مرحباً، أنا سونالي موهانتي من مختبر الدكتور LE في قسم الوراثة الطبية الحيوية بجامعة روتشستر.سنعرض لكم اليوم إجراءً لتنفيذ مقايسة النقائل التجريبية. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة النقائل السرطانية. لذا، فلنبدأ.ابدأ بخلايا نمت حتى وصلت درجة تلاقيها إلى حوالي 70%، ثم اسحب الوسط الغذائي من الطبق واغسله برفق مرة واحدة باستخدام 1X PBS. بعد ذلك، أضف 2 mL من 0.05% Trypsin. هز الطبق برفق لتسهيل انفصال الخلايا.راقب الخلايا تحت المجهر أثناء انفصالها. أضف حجماً وافراً من الوسط الذي يحتوي على FBS لإيقاف نشاط التريبسين. ثم انقلها إلى أنبوب سعة 50 milliliter.قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer). وبمجرد تحديد التركيز، قم بالطرد المركزي بسرعة 200 ×g تقريبًا لمدة ثلاث دقائق دون تعريض كتلة الخلايا المترسبة للاضطراب. أزل الوسط بدقة، ثم أعد تعليق الخلايا بإضافة حجم مناسب من محلول هانكس المنظم المتوازن (Hank's balance buffer solution) أو HBSS للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ حوالي 5 × 10⁶ خلية/ملل.بعد ذلك، قم بالترشيح باستخدام مصفاة خلايا من ماركة Falcon بقطر مسام 70 micrometer. ولاستبعاد تجمعات الخلايا الكبيرة، ضع طرف الماصة مباشرة فوق المصفاة الموضوعة على أنبوب استنبات سعة خمسة milliliter. ثم قم بدفع المعلق بسرعة عبر المصفاة إلى داخل الأنبوب.قم بعدّ الخلايا مرة أخرى باستخدام صبغة tripan blue لتحديد الحيوية. يجب أن تكون الحيوية أكبر من 90% قبل الحقن. ثم قم بالتخفيف للوصول إلى تركيز نهائي قدره 2.5 times 10 to the six cells per milliliter.يُحفظ على الثلج. أمسك بلطف ذيل فأر ناقص المناعة واسحبه إلى داخل مقيد الفئران بحيث يكون ظهره مقابل الشق وذيله بارزاً من الفتحة الصغيرة الموجودة في الخلف. مرر الحلقة ببطء نحو الداخل على طول الشق.بمجرد أن تلتف الحلقة حول فم الفأر، قم بتثبيتها في مكانها. يجب ألا يتمكن الفأر من التحرك بحرية، ولكن يجب أن يكون معدل تنفسه طبيعيًا. حدد مواقع الأوردة الرئيسية في الذيل.توجد أربعة أوعية دموية رئيسية في ذيل الفأر. تقع الشرايين على الجانبين الظهري والبطني من الذيل، بينما تقع الأوردة على الجانبين الجانبيين.اسحب 200 µL على الأقل من الخلايا المُحضّرة في سرنجة سعة 1 mL. ثبّت إبرة مقاس 30 gauge نصفية واطرد أي فقاعات هوائية. يجب أن يكون الحجم النهائي في السرنجة 200 µL.استعد للحقن في الطرف القاصي من الذيل؛ بحيث إذا فشلت المحاولة الأولى، يمكن استخدام منطقة أقرب من قاعدة الذيل لمحاولة ثانية. بعد مسح موقع الحقن بـ 70% ethanol، اسحب الذيل بشكل مستقيم.أمسك الطرف بالإبهام واسند نقطة الحقن بالسبابة. أدخل الإبرة في الوريد واحِقن الخلايا. تأكد من أن الإبرة والمحقنة في وضع موازٍ للوريد أثناء عملية الحقن.وإلا، ستخترق الإبرة جدار الوعاء الدموي وسيتم حقن الخلايا في أنسجة الذيل المجاورة. اسحب الإبرة إذا تمت العملية بنجاح، حيث يجب أن يتدفق الدم من موقع الحقن.اضغط بكرة قطنية نظيفة لتسهيل عملية تنظيف الذيل، ثم قم بجس الذيل للأعلى لدفع أي عينة متبقية إلى الدورة الدموية. حرر الفأر من أداة التقييد وأعده إلى القفص. سجل عدد تجارب الحقن وعدد الخلايا المحقونة في دفتر المختبر.قم بتحديد حيوية الخلايا بعد الحقن. كما في السابق، توفر هذه الخطوة تأكيداً على بقاء الخلايا حية طوال عملية الحقن. في نهاية تجربة الحقن، ستنخفض حيوية الخلايا، ولكن يجب أن تظل فوق 80%. كخطوة اختيارية، قم بطرد الخلايا المتبقية مركزياً ثم اشطف الرواسب باستخدام PBS مرة واحدة.بعد ذلك، جمد الكريات عند -80 °C لإجراء تحليلات مستقبلية مثل western blotting. ولتأكيد التعبير الجيني في حالات knockdown، قم بتشريح الفئران بعد مرور شهر إلى شهرين لتحديد مواقع النقائل. ابدأ بوضع الفأر الذي تم القتل الرحيم له على محطة التشريح.رُش الفأر بسخاء باستخدام الإيثانول. قم بفتح القفص الصدري لكشف الرئتين والقلب. ثم استأصلهما بعناية وضعهما في محلول PBS.تعد الرئة الموقع الأساسي لانتقال الورم لأنها تحتوي على أول سرير شعيري تصادفه الخلايا. بعد دخول الخلايا في الدورة الدموية، قم بإزالة القلب وشطف الرئتين في PBS ثم افحص كل فص من فصوص الرئة تحت مجهر تشريحي. قم بعدد النقائل الورمية التي يمكن اكتشافها على جانبي الرئة، ثم اجمع أعداد نقائل الرئة في جميع الفصوص الأربعة معاً لتحديد العدد الإجمالي لنقائل الرئة.بعد ذلك، قم بعزل النقائل الرئوية الفردية عن طريق الاستئصال باستخدام المقص. انقل كل نقيلة إلى مصفاة خلايا بمسامية 70 micrometer وقم بتفتيتها باستخدام طرف غطاء إبرة معقم. اشطف مصفاة الخلايا بعدة ملليلترات من الوسط واجمع الخلايا التي تمر عبر المرشح.في طبق زرع، يحتوي كل طبق على الخلايا الناتجة عن نقيلة واحدة. تُحضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة أربعة أيام على الأقل دون أي إزعاج. في البداية، ستنمو كل من الخلايا السرطانية وخلايا الأرومات الليفية على الأطباق، ولكن تدريجياً ستنتهي خلايا الأرومات الليفية وتستبدل بالخلايا السرطانية.إذا كانت الخلايا السرطانية تحمل أي جينات مقاومة للأدوية، يتم اختيار الخلايا باستخدام المضادات الحيوية المقابلة. بعد مرور ثلاثة أيام، تُغسل أي بقايا دم أو أنسجة موجودة في الطبق باستخدام PBS، ثم يُضاف وسط غذائي جديد. يتم تقييم نقاء الخلايا المشتقة عن طريق الصبغ المناعي باستخدام أجسام مضادة ضد بروتينات بشرية محددة، وهنا تم استخدام جسم مضاد لمنع التفاعل مع البروتينات البشرية (anti-human menting antibody) حتى في حالة عدم وجود اختيار دوائي. يجب أن تكون نسبة الخلايا البشرية أكثر من 99%.يمكن الآن حقن الخلايا المشتقة حديثاً مرة أخرى في الفئران التي تعاني من نقص المناعة لاختبار قدراتها النقيلة في نهاية هذا المقايسة. عادةً ما يؤدي خط الخلايا السرطانية عالي النقائل إلى ظهور العديد من النقائل الرئوية، بينما ينتج عدد قليل جداً من النقائل الرئوية عن خط خلايا سرطانية ضعيف النقائل. تُظهر هذه الصور النقائل الرئوية بعد شهرين من حقن خط خلايا الميلانوما البشرية.3 7 5 sm. عادة ما تؤدي الخلايا المشتقة باستخدام هذه الطريقة إلى حدوث نقائل أكثر من السلالة الأصلية عند اختبارها. وباستخدام هذا المقايسة مرة أخرى، فقد عرضنا لكم للتو إجراء تنفيذ مقايسة النقائل التجريبية.عند القيام بهذا الإجراء، من المهم جداً تذكر التأكد من حقن الخلايا في الوريد الذيلي، وليس في الأنسجة المحيطة به أو أنسجة الذيل. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

والانبثاث الرئة التجريبية وCTL نموذج الفأر المناعي لتحليل التفاعل خلية ورم الخلايا...

الإنبثاث التجريبية وCTL المناعي نقل بالتبني النموذجي ماوس

باستخدام كمية PCR ، علينا أن نظهر كيف يمكن استخدام نموذج راسخة CAM فرخ لتحليل كمي لورم خبيث من الخلايا السرطانية البشرية إلى الأجهزة البعيدة.

تحليل الكمي الإنبثاث السرطان باستخدام الأجنة النموذجي الطيور

يصف هذا الفيديو بروتوكول إنشاء نموذج فأر ورم خبيث عفوي للطعوم الغريبة المشتقة من سرطان القولون والمستقيم أو PDXs. تحاكي نماذج الطعم الغريب هذه جزئيا سمات الأورام الخبيثة البشرية وتفهم الجوانب الحرجة للأورام الخبيثة البشرية ، بما في ذلك الغزو والورم الخبيث.

نماذج فأر ورم خبيث تلقائي: منصة لدراسة الإمكانات النقيلية لخلايا سرطان القولون والمستقيم المحقونة تقويم العظام

هذا النموذج مثلي من سرطان البروستاتا البشرية يسمح للالكمي لحجم الورم، وتعميم الخلايا السرطانية، وتشكيل ورم خبيث متميزة إلى الرئة. كما يجب أن الهروب خلايا الجهاز الرئيسي، تدخل مجرى الدم، وزرع في موقع ثانوي، وهذا النموذج يلخص بشكل فعال السيناريو في البشر.

على الفئران نموذج مثلي من سرطان البروستاتا البشرية الانبثاث

ويصف هذه المخطوطة طريقة لقياس تراكم خلية ورم في الرئتين في نموذج حيوان من ورم خبيث.

الرئة ورم الخلية تجنيد الإنزيم

يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR) للكشف عن مرنا محددة الخلايا السرطانية تمثل ورم خبيث في الأنسجة الماوس الرئة.

تقييم الرئة الانبثاث في ماوس الثديية ورم المجموعات بواسطة الكمي في الوقت الحقيقي PCR

يلعب ورم خبيث  دورا عميقا في ضراوة السرطان ، حيث يمثل ما يقدر بنحو 90٪ من الوفيات.  أبلغنا عن بروتوكول لنموذج الورم الميلانيني النقيلي في الفئران مفيد لتحديد فعالية العوامل العلاجية ضد هذه الظاهرة السريرية.

حقن خلايا الفئران مسانج الميلانوما لتحديد ما إمكاناتهم الإنتقالية في الرئتين

والهدف من هذه المادة تقديم وصف مفصل للبروتوكول للمقايسة خبيث الرئوية (PuMA). هذا النموذج يسمح للباحثين لدراسة نمو الخلايا osteosarcoma المنتشر (OS) في أنسجة الرئة باستخدام ويديفيلد fluorescence أو مجهر مسح ليزر [كنفوكل].

الاعتبارات العملية في دراسة الاستعمار الرئة المنتشر في أوستيوساركوما باستخدام مقايسة خبيث الرئوية

النهج الموصوف يجمع بين اختبارات الانبثاث الوريد الذيل التجريبية مع في الجسم الحية التصوير الحيواني للسماح الرصد في الوقت الحقيقي لتكوين ورم خبيث سرطان الثدي والنمو بالاضافه إلى التحديد الكمي للعدد الانبثاث وحجم في الرئتين.

الجمع بين استخدام الذيل الوريد الانبثاث الاختبارات والوقت الحقيقي في التصوير فيفو لقياس سرطان الثدي الاستعمار المنتشر والعبء في الرئتين

توضح هذه المقالة سير عمل التقنيات المستخدمة لاختبار الوسطاء المرشحين الجدد لورم خبيث سرطان الجلد وآلية (آليات) عملهم.

منصة اكتشاف قوية لتحديد الوسطاء الجدد لورم خبيث سرطان الجلد

تصف المخطوطة منهجية لإنشاء ومراقبة النمو الطولي للورم الخبيث الرئوي التلقائي من أورام الثدي المحقونة تقويم العظام ، والتي يمكن التدخل في جميع مراحل الشلال النقيلي.

في الجسم الحي تصوير لقياس ورم خبيث في الرئة التلقائي لخلايا ورم الثدي المحقونة تقويم العظام

تعلم تقييم القدرة الإنبثاثية لخلايا سرطان بشرية باستخدام حقن الوريد الذيلي في فئران نقص المناعة. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة سلوك الخلايا السرطانية وتطوير استراتيجيات علاجية فعالة.

الفحص التجريبي الإنبثاث

استكشف المزيد من الفيديوهات