الفحص التجريبي الإنبثاث
أغسطس 24, 2010
توضح هذه المقالة الإجراءات لفحص الانبثاث التجريبية التي تستخدم لتحديد إمكانية النقيلي من خطوط الخلايا السرطانية البشرية.
الهدف العام من التجربة التالية هو اختبار القدرات النقيلية للخلايا السرطانية البشرية عن طريق حقن وريد الذيل. في الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، يتم تحضير الخلايا للحقن. ثم يتم حقن الخلايا في الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، والتي ستولد نقائل في الرئة بعد شهر إلى شهرين.
يتم تشريح الفئران وقياس النقائل الرئوية وزراعتها. تشير نتائج هذا النوع من الفحص إلى مدى النقائل لنوع معين من الخلايا السرطانية. مرحبا ، أنا سونالي موهانتي من مختبر الدكتور LE في قسم علم الوراثة الطبية الحيوية بجامعة روتشستر.
سنعرض لك اليوم إجراء لإجراء فحص ورم خبيث تجريبي. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة ورم خبيث للسرطان. لذلك دعونا نبدأ.
ابدأ بالخلايا التي نمت إلى حوالي 70٪ من الطلاقة في Co ، ووسائط السحب من اللوحة واغسلها برفق مرة واحدة باستخدام XPBS واحد. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من 0.05٪ عكس التربسين. هز اللوحة برفق لتسهيل انفصال الخلية.
راقب الخلايا تحت المجهر أثناء انفصالها. أضف حجما كبيرا من الوسائط التي تحتوي على FBS لإخماد الرحلات في النشاط. ثم نقل إلى أنبوب 50 ملليلتر.
عد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي. بمجرد تحديد التركيز ، جهاز الطرد المركزي عند حوالي 200 مرة من الجاذبية لمدة ثلاث دقائق دون إزعاج حبيبات الخلية. قم بإزالة الوسائط بعناية Resus معلقة حجما مناسبا من محلول المخزن المؤقت لتوازن هانك أو HBSS للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ حوالي خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر.
بعد ذلك ، قم بالتصفية من خلال مصفاة خلية Falcon سعة 70 ميكرومتر. لاستبعاد مجاميع الخلايا الكبيرة، ضع طرف الماصة مباشرة على الفلتر، ووضعه فوق أنبوب استزراع سعة خمسة ملليلتر. قم بإخراج التعليق بسرعة من خلال الفلتر إلى الأنبوب.
عد الخلايا مرة أخرى باستخدام trian blue لتحديد الجدوى. يجب أن تكون الجدوى أكبر من 90٪ قبل الحقن. ثم يخفف إلى تركيز نهائي 2.5 في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر.
ابق على الجليد. أمسك ذيل الفأر المصاب بنقص المناعة برفق واسحبه إلى مصفاة الماوس مع ظهره على الشق وذيله بارز من الفتحة الصغيرة في الخلف. حرك الحلقة ببطء إلى الداخل على طول الشق.
بمجرد أن تلتقط الحلقة فم الماوس ، قم بإثبتها في مكانها. يجب ألا يكون الماوس قادرا على التحرك بحرية ، ولكن يجب أن يكون معدل التنفس طبيعيا. ابحث عن أوردة الذيل الرئيسية.
توجد أربعة أوعية دموية رئيسية في ذيل الفأر. تقع الشرايين على الجانبين الظهري والبطني للذيل. تقع الأوردة على الجانبين الجانبي.
ارسم ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من الخلايا المحضرة في حقنة سعة مليلتر واحد. قم بتوصيل إبرة نصف قياس 30 وادفع أي فقاعات هواء للخارج. يجب أن يكون الحجم النهائي في المحقنة 200 ميكرولتر.
استعد للحقن في الطرف البعيد من الذيل. لذلك إذا فشلت التجربة الأولى ، فيمكن استخدام منطقة أكثر قربا من الذيل في محاولة ثانية. بعد مسح موقع الحقن بنسبة 70٪ من الإيثانول ، اسحب الذيل بشكل مستقيم.
أمسك الطرف بالإبهام وادعم نقطة الحقن بإصبع السبابة. أدخل الإبرة في الوريد وحقن الخلايا. تأكد من أن الإبرة والحقنة موازية للوريد أثناء الحقن.
خلاف ذلك ، سوف تخترق الإبرة جدار الوعاء الدموي وسيتم حقن الخلايا في أنسجة الذيل المجاورة. اسحب الإبرة إذا سار الإجراء بنجاح. يجب أن يتدفق الدم من موقع الحقن.
اضغط على كرة قطنية نظيفة لتسهيل تنظيف الخيط وتلس الذيل لأعلى لدفع أي عينة متبقية إلى الدورة الدموية. حرر الماوس من المقنع وأعده إلى القفص. سجل عدد تجارب الحقن وعدد الخلايا المحقونة في دفتر المختبر.
تحديد صلاحية الخلايا بعد الحقن. كما كان من قبل ، توفر هذه الخطوة الطمأنينة بأن الخلايا تبقى على قيد الحياة طوال عملية الحقن. في نهاية تجربة الحقن ، ستنخفض صلاحية الخلايا ، ولكن يجب أن تظل أعلى من 80٪ كخطوة اختيارية ، قم بتدوير الخلايا المتبقية واشطف الكريات باستخدام PBS مرة واحدة.
ثم قم بتجميد الكريات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لإجراء تحليلات مستقبلية مثل النشاف الغربي. لتأكيد التعبير الجيني على الضربة القاضية بعد شهر إلى شهرين ، قم بتشريح الفئران لتحديد مواقع النقائل. ابدأ بوضع الماوس القتل الرحيم على محطة التشريح.
رش الماوس بسخاء بالإيثانول. اقطع القفص الصدري لكشف الرئتين والقلب. ثم قم باستئصالها بعناية ووضعها في PBS.
الرئة هي الموقع الأساسي للورم الخبيث لأنها تحتوي على أول سرير شعري تواجهه الخلايا. بعد دخولها الدورة الدموية ، قم بإزالة القلب وشطف الرئتين في PBS ثم راقب كل فص من الرئة تحت مجهر تشريح. احسب عدد النقائل التي يمكن اكتشافها على جانبي الرئة ، ثم حسب عدد نقائل الرئة على جميع الفصوص الأربعة معا لتحديد العدد الإجمالي لنقائل الرئة.
بعد ذلك ، قم بعزل نقائل الرئة الفردية عن طريق الاستئصال باستخدام المقص. انقل كل ورم خبيث إلى مصفاة خلية 70 ميكرومتر وافرمها باستخدام نهاية غطاء إبرة معقم. اشطف مصفاة الخلية بعدة ملليلتر من الوسط واجمع الخلايا التي تمر عبر الفلتر.
في طبق الاستزراع ، يحتوي كل طبق على خلايا من ورم خبيث واحد. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة أربعة أيام على الأقل دون إزعاج. في البداية ، ستنمو كل من الخلايا السرطانية وخلايا الخلايا الليفية على الصفائح ، ولكن تدريجيا ستموت خلايا الخلايا الليفية وتحل محلها الخلايا السرطانية.
إذا كانت الخلايا السرطانية تحمل أي جينات مقاومة للأدوية ، فحدد الخلايا التي تحتوي على المضادات الحيوية المقابلة بعد ثلاثة أيام ، اغسل أي بقايا دم أو أنسجة ، وحطام على الطبق باستخدام PBS وأضف وسيطا جديدا. قم بتقييم نقاء الخلايا المشتقة عن طريق التلوين المناعي بالأجسام المضادة ضد البروتينات البشرية المحددة هنا ويتم استخدام الأجسام المضادة للإنسان حتى في حالة عدم وجود اختيار الدواء. يجب أن تكون أكثر من 99٪ من الخلايا بشرية.
يمكن الآن حقن الخلايا المشتقة حديثا مرة أخرى في الفئران التي تعاني من نقص المناعة لاختبار قدراتها النقيلية في نهاية هذا الفحص. عادة ما يؤدي خط الخلايا السرطانية النقيلي للغاية إلى ظهور العديد من النقائل الرئوية ، في حين أن عددا قليلا جدا من نقائل الرئة ستأتي من خط خلايا سرطانية نقيلي ضعيف. تظهر هذه الصور نقائل الرئة بعد شهرين من حقن خط خلايا الورم الميلانيني البشري.
أ 3 7 5 سم. عادة ما تؤدي الخلايا المشتقة باستخدام هذه الطريقة إلى ورم خبيث أكثر من الخط الأبوي عند اختبارها. مرة أخرى باستخدام هذا الاختبار ، لقد أظهرنا لك للتو إجراء إجراء فحص ورم خبيث تجريبي.
عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم جدا أن تتذكر التأكد من حقن الخلايا في الوريد الذيل ، ولكن ليس في أنسجة الذيل والذيل. هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة اختبار استعصاء تجريبياً يُستخدم لتقييم الإمكانية الاستعصائية لخطوط خلايا سرطان الإنسان من خلال حقن الوريد الذيلي في الفئران عديمة المناعة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأورام
- بحث الاستعصاء
- علم الأحياء التجريبي
الخلفية
- فهم استعصاء السرطان ضروري لتطوير علاجات فعالة.
- تساعد الاختبارات التجريبية في تحديد الإمكانية الاستعصائية لخلايا السرطان.
- توفر الفئران عديمة المناعة نموذجًا مناسبًا لدراسة سلوك خلايا سرطان الإنسان.
- حقن الوريد الذيلي هي طريقة شائعة لتقييم استعصاء الرئة.
غرض الدراسة
- لاختبار القدرات الاستعصائية لخلايا سرطان الإنسان.
- لتحديد وزراعة استعصاء الرئة الناتج عن الخلايا المحقونة.
- لتوفير رؤى حول الإمكانية الاستعصائية لخطوط خلايا سرطان مختلفة.
الطرق المستخدمة
- تحضير خلايا سرطان الإنسان للحقن.
- حقن الخلايا في الوريد الذيلي للفئران عديمة المناعة.
- مراقبة تطور استعصاء الرئة على مدى شهر إلى شهرين.
- تشريح الفئران لتحديد وزراعة استعصاء الرئة.
النتائج الرئيسية
- النجاح في توليد استعصاء الرئة من الخلايا السرطانية المحقونة.
- يوفر تحديد استعصاء الرئة بيانات عن الإمكانية الاستعصائية.
- يمكن استخدام استعصاء الرئة المزروع في تحليلات إضافية.
- تشير النتائج إلى تنوع في القدرات الاستعصائية بين خطوط خلايا سرطان مختلفة.
الاستنتاجات
- اختبار الاستعصاء التجريبي فعال في تقييم سلوك خلايا السرطان.
- يمكن أن تفيد الرؤى المكتسبة في وضع استراتيجيات علاجية ضد السرطان الاستعصائي.
- يمكن أن تبني الدراسات الإضافية على هذه النتائج لاستكشاف الآليات الكامنة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
The experimental metastasis assay provides a quantitative in vivo model to assess the metastatic potential of human cancer cell lines, supporting target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery. By enabling the isolation and propagation of highly metastatic derivatives, the assay facilitates the identification of genes and pathways regulating metastatic progression, thereby informing lead identification and preclinical prioritization. This approach enhances predictive confidence in downstream therapeutic development by linking in vitro findings to functional metastatic outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying metastatic ability of cancer cells following genetic or pharmacological perturbation.
- Operational Value: Provides a reproducible in vivo readout for functional target validation in metastasis-relevant pathways.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking molecular alterations to metastatic phenotypes in immunocompromised mice.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative metastasis counts that serve as dependent variables for screening modulators of metastatic dissemination.
- Operational Value: Standardizes cell preparation, injection, and tissue harvesting procedures to ensure reproducibility across experiments.
- Scientific Value: Enables derivation of metastatic cell lines with enhanced invasive properties for use in secondary screening and target deconvolution.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses a disease-relevant system where lung metastasis formation mirrors clinical patterns of hematogenous spread.
- Operational Value: Supports longitudinal studies by allowing re-injection of cultured metastases to assess stability of the metastatic phenotype.
- Scientific Value: Facilitates biomarker discovery by enabling molecular profiling of isolated metastases compared to parental lines.
Pipeline & Workflow Integration
The assay functions as a discovery-stage tool that bridges target hypothesis testing with phenotypic validation, informing decisions on compound progression and mechanistic follow-up in oncology pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of metastasis regulators through quantitative lung colonization assays.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs (metastasis number per lung) enabling comparison across genetic or chemical conditions.
- Analytics: Generates count-based data suitable for statistical analysis to determine significant differences in metastatic potential.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation by providing a model that reflects organ-specific metastatic tropism.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating metastatic capacity across multiple cancer types and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by demonstrating causal links between gene modulation and metastatic suppression or enhancement.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized cell viability thresholds (>90% pre-injection, >80% post-injection) and standardized injection volumes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional metastasis data that complements in vitro invasion and proliferation assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their demonstrated effect on metastatic burden in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, intravenous injection techniques, and aseptic tissue dissection.
- Dependent on access to immunodeficient mouse models and facilities for long-term animal housing (one to two months).
- Necessitates standardized protocols for cell preparation, viability assessment, and metastasis quantification to minimize variability.
- Involves technical considerations for metastasis isolation, including enzymatic or mechanical dissociation and filtration to obtain single-cell cultures.
- Limited to modeling early dissemination and lung colonization; does not capture later stages of metastasis such as extravasation or distant organ growth beyond the lung.
