مزمن السالمونيلا نموذج الفأر المصاب

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نموذج فأر مصاب بعدوى السالمونيلا المزمنة. يتم تحقيق ذلك من خلال تحضير محلول السالمونيلا أولاً، ثم تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إعطاء الفئران الستربتوميسين عن طريق التزقيم، يليه السالمونيلا أو الستربتوميسين فقط.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في عزل السالمونيلا (salmonella) من براز الفئران، والكشف عن عدوى السالمونيلا في أمعاء الفئران باستخدام أطباق BL chroma. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي مراقبة وتسجيل كتلة جسم الفئران وتدوين التغيرات في حيويتها بعد الإصابة بعدوى السالمونيلا. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر إمكانية إحداث عدوى بالسالمونيلا في أمعاء الفئران التي خضعت للتغذية القسرية بالسالمونيلا.

مرحباً، أنا ميشيل بي من مختبر الدكتور جونسون في قسم الطب بجامعة روتشستر. وأنا من مختبر صن، وأنا واي من مختبر صن. سنعرض لكم اليوم إجراءً لإنشاء نموذج كتلة مصابة بـ Alytic Lennar.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة نقل إشارات التفاعل بين البكتيريا والعائل وتكون الأورام. لذا، فلنبدأ. قبل البدء بالتجارب، قم بتحضير عدد كافٍ من أطباق وسط Luria-Bertani أو LB broth لكل سلالة من سلالات salmonella لاستخدامها طوال فترة التجربة.

يمكن تبريد الأطباق وتخزينها لعدة أشهر. بعد ذلك، قم بتحضير مزرعة السالمونيلا. أخرج قارورة من مخزون السالمونيلا المجمدة عند درجة حرارة 80- °C واتركها تذوب على سطح المختبر لزراعتها في أطباق السالمونيلا.

قم بتعقيم عروة التلقيح في لهب موقد بنزن، ثم اغمسها في المخزون البكتيري المذاب. حرك العروة بشكل زجزاجي ذهاباً وإياباً على الثلث العلوي من طبق LB. عقم العروة بلهب الموقد مرة أخرى ثم قم بتدوير الطبق.

حرك العروة بشكل متعرج لتقاطع الخطوط السابقة وتوزيع البكتيريا على الثلث الثاني من الطبق. كرر العملية مرة أخرى، ثم قم بتعقيم العروة باللهب مجدداً.

تجنب غرس الحلقة في الآجار. اترك المستعمرات لتنمو عن طريق تخزين الأطباق في حضانة عند درجة حرارة 37 degree Celsius طوال الليل. إذا تم الإجراء بشكل صحيح، يجب أن ينتج طبق السالمونيلا مستعمرات فردية في قسم واحد على الأقل.

في اليوم التالي، اختر مستعمرة واحدة من طبق LB باستخدام خلة أسنان معقمة أو عروة بكتيرية وضعها في 7 mL من وسط LB في أنبوب سعة 12 mL. رج الأنبوب عند درجة حرارة 37 °C لمدة خمس ساعات تقريبًا.

استخدم 0.05 milliliters من هذه المزرعة للتلقيح في 50 milliliters من وسط LB داخل أنبوب Falcon. يتم التحضين عند 37 درجة Celsius بدون هز لمدة 18 ساعة تقريباً.

قم بطرد 50 milliliter من المزرعة البكتيرية التي نمت طوال الليل مركزياً في درجة حرارة الغرفة عند 5,000 RPM لمدة 10 دقائق وتخلص من supernatant. بعد ذلك، أضف 1.5 milliliters من محلول ملح هانك المنظم أو HBSS إلى الأنبوب لإعادة تعليق البكتيريا أو بنسبة 100 جزء lb إلى ثلاثة أجزاء HBSS. ثم أكمل الحجم الإجمالي إلى 15 milliliters باستخدام HBSS أو بنسبة 1 إلى 10 من LB إلى HBSS.

يتطلب كل فأر 100 µL من مستنبت السالمونيلا المخفف، أو ما بين 1×10⁶ إلى 1×10⁸ من الوحدات المكونة للمستعمرات قبل البدء في التغذية القسرية؛ مع سحب الماء والطعام من الفئران قبل أربع ساعات من التجربة. بعد ذلك، قم بتحضير محلول الستريبتومايسين مباشرة قبل التغذية القسرية عن طريق تخفيف 7.5 mg من مسحوق الستريبتومايسين في 100 µL من HBSS. وبالنسبة لكل فأر يتم حقنه، تأكد من تحضير حجم إضافي لتعويض الفقد الذي يحدث قبل التغذية القسرية للفأر.

أولاً، قم بتجهيز إبرة التغذية بـ 100 µL من محلول الستربتومايسين. أخرج الفأر الأول من القفص لإجراء التغذية القسرية وثبته بحيث يكون وجهه مقابلاً لسطح المنضدة. أمسك الجلد فوق كتف الفأر بإحكام باستخدام الإبهام والإصبع الوسطى، مع تمديد الرأس والرقبة باستخدام إصبع السبابة لجعل المريء مستقيماً.

وجه الطرف الكروي لإبرة التغذية على طول سقف الفم وباتجاه الجانب الأيمن من الجزء الخلفي للبلعوم. ثم مررها برفق إلى الأسفل في المريء واحقن 100 µL من محلول الستربتومايسين. يجب عدم الشعور بأي مقاومة.

كرر هذه العملية لجميع الفئران التجريبية وفئران المجموعة الضابطة الخاضعة للتجربة. بعد مرور حوالي 20 ساعة من عملية strp de m والتزقيم، وقبل أربع ساعات من التزقيم بـ salmonella، اسحب الماء والطعام من الفئران التي ستتلقى التزقيم الفموي بـ salmonella. قم بتزقيم كل فأر بنفس الطريقة السابقة، باستخدام 100 µL من محلول salmonella في HBSS.

بعد عملية التزقيم، انقل كل فأر إلى قفص جديد لبدء جمع البراز. بدءاً من حوالي ثماني ساعات بعد التزقيم، قم بإزالة المادة البرازية من القفص فور سقوطها. اجمع 100 milligrams من براز الفأر كعينة تجريبية.

اجمع العينات يومياً أو أسبوعياً اعتماداً على مدة الدراسة لتحليل السالمونيلا في المواد البرازية. انقل العينة البرازية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter مع 1 milliliter من PBS، ثم قم بالرج بقوة باستخدام جهاز vortex، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق بسرعة 800 RPM. انقل الراشح إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 milliliter وقم بالطرد المركزي بسرعة 6,000 RPM لمدة خمس دقائق.

تخلص من الطافي وأضف 200 µL من PBS إلى الرواسب ثم استخدم جهاز vortex لإعادة التعليق. بعد ذلك، يتم الكشف عن السالمونيلا باستخدام طبق BB l roag. استخدم من 10 إلى 100 µL من محلول المادة البرازية لكل طبق، مع توزيعها على الطبق كما هو موضح في القسم الثاني.

تظهر أنواع السالمونيلا باللون الماروني نتيجة للاختلافات الأيضية في وجود مواد مولدة للألوان مختارة. قم بعد مستعمرات السالمونيلا على الطبق لمقارنة مستوى العدوى بين الفئران الفردية. في هذا الإجراء التجريبي، استخدمنا إناث فئران C 57 black six خالية من مسببات الأمراض المحددة، تتراوح أعمارها بين ستة إلى سبعة أسابيع.

تم إصابة الفئران ببكتيريا السالمونيلا والستربتومايسين بالإضافة إلى محلول HBSS. وتم استخدام مجموعة ضابطة من الفئران التي خضعت للتغذية القسرية باستخدام الستربتومايسين فقط. شملت سلالات السالمونيلا المستخدمة سلالة السالمونيلا التيفية (Salmonella typhimurium) من النوع البري، A TCC 1 4 0 2 8 S FP C، وسلالة سالمونيلا طافرة غير ممرضة، وثلاث سلالات FPC من مختبر الدكتور جيمس ماديرا تحمل جين AAV R age المرتبط بالضراوة في بلازميد PSKW 29 منخفض النسخ. وباستخدام هذا البروتوكول، يمكن الكشف عن استعمار السالمونيلا التيفية في أمعاء الفأر.

تم قياس العدوى المزمنة بـ salmonella من خلال تحليل البراز، كما جُمعت عينات من وزن الجسم وأنسجة الأمعاء لإجراء صبغ مناعي فلوري. وعادةً ما يحدث فقدان في وزن الجسم ووفاة في غضون أربعة أسابيع بعد العدوى. وتظهر هنا نسب البقاء على قيد الحياة بعد أربعة أسابيع من العدوى.

بمجرد أن تنجو الفئران من الأسابيع الأربعة الأولى بعد العدوى، تزداد أوزان أجسامها وتنخفض معدلات الوفيات في الأسابيع الـ 23 المتبقية. وبشكل عام، يمكن لأكثر من 65% من الفئران المصابة بسلالات السالمونيلا FSY fsy أو A VRA null أو fsy. A VRA heterozygote البقاء على قيد الحياة لأكثر من ستة أشهر مع وجود عدوى سالمونيلا مستمرة في الأمعاء.

بعد العدوى الحادة، ظل الناجون حاملين لبكتيريا السالمونيلا، والتي أمكن الكشف عنها بعد ستة أشهر من الإصابة باستخدام الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول. ويظهر تحليل التألق المناعي لعينات نسيجية من أمعاء الفئران غزو السالمونيلا للمخاطية المعوية بعد 27 أسبوعاً من الإصابة. في هذه الصورة، تظهر النوى مصبوغة باللون الأزرق، بينما تظهر السالمونيلا المصابة باللون الأخضر.

كما يظهر في المجموعة الضابطة، لا يوجد تلوين أخضر ساطع، مما يشير إلى عدم وجود استعمار لبكتيريا السالمونيلا. بينما في الفئران المصابة بالسالمونيلا بعد 27 أسبوعاً من العدوى، يوجد تلوين أخضر ساطع في المخاطية المعوية. وهذا يوضح استمرار عدوى السالمونيلا في الفئران التي عولجت مسبقاً بالستريبتومايسين.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحفيز العدوى المزمنة في نموذج الفأر. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تحضير المزرعة حديثاً لعملية التلقيح، واتباع مهارات تلقيح صحيحة، والكشف عن وجود ANA للتأكد من أن النموذج التجريبي يعمل بشكل صحيح. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.