ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

يختبر هذا الإجراء تفاعل بروتين البروتين في الجسم الحي بين اثنين من منظمي نسخ نبات الأرابيدوبسيس ، seus مكتوب SEU ، باختصار و lu holog أو LUH. من خلال استخدام تكملة التألق الجزيئي الحيوي ، يتم دمج seus في الجزء الطرفي النهائي لبروتين فلوري أصفر ، أو يتم دمج YFP و LUH في الجزء الطرفي C من Y-F-P-D-N-A من بنيتين البلازميدتين. يتم قصف Seuss, NYFP و L-U-H-C-Y-F-P في خلايا بشرة البصل لاختبار تفاعلها.

يؤدي التفاعل بين Seuss و LUH إلى ارتباط الطرف النهائي والشظايا الطرفية C ل YFP في النوى مما يؤدي إلى تألق YFP في النوى. بعد الحضانة لمدة 16 إلى 20 ساعة في الظلام ، لوحظت قشور بشرة البصل تحت المجهر الفلوري من أجل تصور التألق. مرحبا ، أنا كورتني هولاندر من مختبر الدكتور Zhi Lu في قسم بيولوجيا الخلية وعلم الوراثة الجزيئية بجامعة ماريلاند.

سنعرض لك اليوم إجراء لاختبار تفاعل البروتين والبروتين في خلايا البصل باستخدام مسدس جين BioRad Helios. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لاختبار تفاعلات البروتين والبروتين وتوطين البروتين في الخلايا النباتية. لذلك دعونا نبدأ.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد خراطيش لمسدس الجينات Helios باتباع بروتوكول Joe Video بواسطة Woods and Zeto 2008 الذي يوضح بالتفصيل إجراء تحضير الخرطوشة لكل تحضير للخراطيش. يتم خلط 50 ميكروغراما من إجمالي الحمض النووي للبلازما مع 12.5 ملليغرام من جزيئات الذهب و 0.5 ملليغرام لكل مليلتر من محلول PVP ل BIFC. من خلال الجمع بين نفس مستحضر الخرطوشة ، تم دمج الحمض النووي للبلازما للبروتينات المتفاعلة المفترضة Seuss في النصف الطرفي N من YFP ، المختصر seus ، NYFP و LU Homolog المدمجين في النصف الطرفي C من YFP المختصر L-U-H-C-Y-F-P.

الكمية المجمعة هي 50 ميكروغراما لكل تحضير ، مما ينتج عنه ما يصل إلى 50 خرطوشة بميكروغرام واحد من الحمض النووي لكل 0.25 ملليغرام من الذهب لكل خرطوشة. كل خرطوشة لطلقة واحدة. بعد تحضير الخرطوشة ، اختبر الخراطيش لمعرفة ما إذا كانت جزيئات الذهب مدفوعة بكفاءة.

لف قطعة مربعة من الطفيلي حول طبق بتري. ثم اضبط ضغط الهيليوم على ما بين 150 و 200 رطل لكل بوصة مربعة وأطلق الخراطيش المصنوعة حديثا في مربع البارام. لاحظ جزيئات الذهب الباهتة على العطر.

يمكن دفع كميات مختلفة من جزيئات الذهب على العطر عند ضغوط الهيليوم المختلفة. ومع ذلك ، إذا لم يكن هناك فرق كبير ، فاختر الضغط المنخفض للقصف. يشير هذا الاختبار أيضا إلى المنطقة التي تغطيها كل طلقة.

لتحضير مناديل البصل ، انزع القشرة الخارجية من بصلة صفراء كبيرة باستخدام شفرة حلاقة نظيفة وحادة. قطع مساحة مستطيلة بحجم سنتيمترين في ثمانية سنتيمترات ، بعمق أربع إلى خمس طبقات. أخرج نسيج البصل المستطيل وتخلص من الطبقتين الخارجيتين.

نقطع الطبقات المتبقية من البصل إلى قطع مربعة تبلغ مساحتها حوالي 1.5 سم مربع. ضع قطع البصل في طبق بتري يحتوي على دوائر من ورق الترشيح ثلاثة مم. مبلل بالماء المعقم يغطي طبق بتري.

قطع البصل جاهزة للقصف. أولا قم بتحميل الخراطيش في حوامل الخرطوشة المستديرة البيضاء ، وتحميل الخراطيش التي تحتوي على تركيبات بلازميد مختلفة في حاملات خراطيش مختلفة. يمكن لكل حامل خرطوشة استيعاب ما يصل إلى 12 خرطوشة ل 12 طلقة.

يتم تحميل ثلاثة حوامل مختلفة هنا. يحتوي الحامل الأول على خراطيش تحتوي على 35 مروج قوي وتأسيسي من فيروس فسيفساء القرنبيط. يعمل هذا البلازميد كعنصر تحكم إيجابي.

تحميل الحامل الثاني بالخراطيش التجريبية التي تحتوي على كمية متساوية من S-E-U-N-Y-F-P و L-U-H-C-Y-F-P. يتم تحميل حامل الخرطوشة الثالث بخراطيش تحتوي على مزيج مولاري متساو من ناقل العمود الفقري عفريت وتوابل LUH عفريت. هذا أيضا بمثابة تحكم سلبي.

أدخل البطارية وبطانة البرميل الجديدة في مسدس جين هيليوس. تأكد من أن كل من بطانة البرميل والبندقية متصلة بحلقات O الخاصة بهما. بعد ذلك ، أدخل حامل خرطوشة فارغا في مسدس الجينات مع العلامة رقم 12 على حامل الخرطوشة المواجه للجزء العلوي من البندقية.

قم بتقديم حامل الخرطوشة مرة أو مرتين للتأكد من إدخاله بشكل صحيح. ثم قم بتوصيل البندقية بخزان الهيليوم واضبط الضغط على ما بين 150 و 200 حصان. أرتدي واقيا للأذن وأطلق النار على البندقية عدة مرات عن طريق الضغط باستمرار على الزر الجانبي أثناء سحب الزناد. إطلاق البندقية بحامل الخرطوشة الفارغة ، وتحميلها ينظف غرفة البندقية ويضمن استقرار الضغط.

قبل تصوير الحمض النووي ، يمكن أن يكون تصوير قطعة من البصل هنا عنصرا سلبيا في تألق الخلفية. لإطلاق جزيئات الذهب المطلية بالحمض النووي ، قم بإزالة حامل الخرطوشة الفارغ وأدخل حامل الخرطوشة الأول الذي يحتوي على التحكم الإيجابي. قم بتقديم حامل الخرطوشة بحيث يتم وضع الخرطوشة المخصصة لإطلاق النار في الجزء السفلي من حامل الخرطوشة.

الآن ضع قطع البصل في منتصف طبق بتري فارغ بحيث تكون الطبقة الداخلية من البصل متجهة لأعلى. ضع بطانة برميل مسدس الجينات على طبق بتري وأطلق النار على البندقية. تقدم إلى الخرطوشة التالية وأطلق النار على قطعة بصل مختلفة.

كرر هذه الخطوة حتى يتم تصوير أربع إلى خمس قطع من البصل. يتم إطلاق النار على كل قطعة بصل مرة واحدة فقط بعد إطلاق النار. انقل قطعة البصل المقصف إلى طبق بتري يحتوي على ورق ترشيح رطب بطول ثلاثة مم لإطلاق الخراطيش التجريبية.

التغيير إلى خرطوشة هولدن. ثانيا ، تذكر تغيير بطانة البرميل لمنع التلوث. أطلق النار على أربع إلى خمس قطع بصل كما هو موضح للتو للتحكم الإيجابي.

ثم قم بالتغيير إلى خرطوشة هولدن. رقم ثلاثة ، يحتوي على الحمض النووي السلبي للتحكم ومرة أخرى ، أطلق النار على أربع إلى خمس قطع بصل.

قم بتغيير بطانة البرميل لمنع التلوث. بعد القصف. غطي أطباق بتري التي تحتوي على قطع البصل بأغطية.

لفها بالشكلي لمنع الجفاف. تحتضن قطع البصل في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 16 إلى 48 ساعة. بمجرد الانتهاء من القصف ، قم بإيقاف تشغيل الغاز وتحرير الضغط قبل فصل مسدس الجينات عن خزان الهيليوم ، وفك بطانة البرميل وإزالة حامل الخرطوشة والخراطيش المستخدمة.

أخيرا ، قم بتنظيف حاملات الخرطوشة وبطانات الأسطوانة عن طريق غمرها في دورق بالماء والصابون والصوت. لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، اشطفها بالماء لإزالة جميع بقايا الصابون.

نقع في 70٪ من الإيثانول لمدة ساعة ثم جفف على مناشف ورقية. استمر في مراقبة قطع البصل بعد 16 إلى 20 ساعة من القصف. بعد احتضان قطع البصل المقصف لمدة 16 إلى 20 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، استخدم ملقطا ذو نهايات مسطحة لتقشير طبقة خلية واحدة ببطء من البشرة الداخلية للبصل.

هذه هي الطبقة التي تواجه البندقية مباشرة أثناء القصف. ضع الطبقة المقشرة على قطرة ماء على غطاء منزلق مع زلة غطاء. لكن كن حذرا لتقليل الفقاعات.

لاحظ مضان GFP أو YFP باستخدام مجهر مضان مثل مراقب zes axio ، النقطة Z الأولى الموضحة هنا تحت المجال الساطع للمجهر. تحقق أولا من تدفق السيتوبلازم للتأكد من أن الخلايا على قيد الحياة. للقيام بذلك.

قم بتعريض الشريحة لضوء المجال الساطع لبضع دقائق لتسخين أنسجة البصل ثم ابحث عن البلاستيك المتحرك ليس من السهل دائما رؤية التدفق السيتوبلازمي ، لذلك لا تثبط عزيمتك إذا لم يكن مرئيا بوضوح. للكشف عن التألق ، استخدم مرشحات الإثارة والكشف المناسبة ل GFP أو YFP. تحقق أيضا من عناصر التحكم السلبية ، وهي قطع البصل التي تم تصويرها ببلازميد غير فلوري.

قد تظهر إشارات صفراء باهتة من الخلايا المصابة والحطام والبصل. تحقق أيضا من الضوابط الإيجابية. البلازميد الذي يحتوي على مراسل الفلورسنت المعبر عنه بشكل أساسي.

يظهر مضان GFP في بعض الخلايا وليس كلها. قد تنتج فقاعات الهواء أيضا تألق الخلفية. تشير إشارات GFP المرئية من خلايا بشرة البصل إلى أن الخراطيش وأنسجة البصل وإطلاق مسدس الجينات يتم إعدادها وتنفيذها بشكل صحيح.

يظهر هنا التألق القوي الذي لوحظ من البلازميد الإيجابي 35 SGFP. يظهر التألق القوي في الخلية بأكملها ، بما في ذلك كل من النواة والسيتوبلازم. تسمح صورة الحقل الساطع للمرء برؤية المخطط المقابل للخلايا والنوى.

لا يتم تحويل كل خلية. يتم الكشف عن إشارة الفلورسنت YFP في نواة خلية البصل عندما يتم قصف التركيبة التجريبية Seuss و NYFP و L-U-H-C-Y-F-P في خلايا البصل مما يشير إلى أن Seuss NYFP و L-U-H-C-Y-F-P يتفاعلان في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن هذا التألق بوساطة التفاعل أضعف بكثير من التألق بوساطة 35 SGFP في التحكم الإيجابي.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم توطين عوامل النسخ SEUS و LUH في النوى. وبالتالي ، لوحظ تألق YFP فقط في النواة. علاوة على ذلك ، فإن عدد الخلايا الفلورية أقل بكثير من عدد الخلايا الإيجابية 35 SGFP.

وذلك لأن B FFC يعمل فقط عندما يتم التعبير عن كلا البلازميدات الشريكة في نفس خلايا البصل. لم يتم الكشف عن أي إشارة فلورية في البصل ، حيث تم قصفها بحامل الخرطوشة رقم ثلاثة الذي يحتوي على مزيج من العمود الفقري ، والمتجه و L-U-H-C-Y-F-P كما هو متوقع من التحكم السلبي. لقد أوضحنا لك للتو كيفية قصف خلايا البصل لاختبار تفاعلات البروتين البروتيني باستخدام نظام مسدس الجينات BioRad Helios.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام عناصر التحكم الإيجابية والسلبية المناسبة وأن تعرف أن مضان BIFC قد يكون أضعف في الإشارة وأقل في عدد الخلايا الفلورية. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.