تحليل التعبير الجيني في الحفار الرماد الزمرد ( Agrilus planipennis) عن طريق ريال الكمية من الزمن - PCR

الهدف العام من التجربة التالية هو تحليل التعبير الجيني في أنسجة ومراحل نمو حشرة emerald ash Borer باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (quantitative PCR). ويتم تحقيق ذلك من خلال تشريح أنسجة اليرقات وتصنيف مراحل النمو. وكخطوة ثانية، يتم استخلاص RNA من الأنسجة ومراحل النمو باستخدام كاشف triol، والذي يُستخدم بعد ذلك كقالب لتوليد الشريط الأول، cDNA، وبعد تخليق الشريط الأول من cDNA، يتم إجراء quantitative RT-PCR.

تم الحصول على نتائج تظهر تعبيراً تفاضلياً للجين المستهدف في أنسجة يرقية ومراحل نمو مختلفة، وذلك بناءً على بيانات التغير الكاملة المستمدة من قيم عتبة الدورة بعد تضخيمات quantitative R-T-P-C-R. مرحباً، أنا براكاش مي، الباحث الرئيسي لهذا المختبر في قسم علم الحشرات بجامعة ولاية أوهايو.

يركز مختبري بشكل أساسي على الجوانب الجينومية أو الجزيئية للتفاعلات بين حشرة خنفساء الرماد الزمردية والرماد. وتُعد خنفساء الرماد الزمردية (EAB) آفة غازية دخيلة من الصين، وهي تهدد وجود مجتمعات أشجار الرماد في جميع أنحاء أمريكا الشمالية. سنعرض لكم اليوم بروتوكولاً لتعلم تحليل التعبير الجيني في خنفساء الرماد الزمردية باستخدام تقنية QPCR أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي.

أعضاء المختبر الذين سيشاركون في هذا البروتوكول هم Swapna pri ou، التي ستقوم بعمليات تشريح الصمام، ثم bin Bandari التي ستوضح عملية عزل RNA. وأخيراً، ستقوم Lauren Rivera Vega بإجراء تحليل QPC. نحن نستخدم هذا الإجراء أيضاً في مختبرنا لدراسة التعبير الجيني لـ ash.

لنبأ الآن. قبل البدء في هذا الإجراء، ضع يرقات خنفساء الرماد الزمردية (emerald ash B) أو EAD على ورق أنسجة رطب. وحتى يتم إجراء عمليات التشريح، احتفظ بمحلول ملحي منظم بالفوسفات بتركيز 1x أو PBS المحضر حديثاً على الثلج للحفاظ على برودة المحلول المنظم طوال عملية التشريح.

للبدء، قم بتثبيت يرقات EAB على لوح التشريح باستخدام دبابيس تشريح دقيقة. ثم أضف cold one XPBS إلى لوح التشريح. أولاً، قم بقطع رؤوس اليرقات باستخدام مقص تشريح دقيق.

بعد ذلك، قم بإزالة القطعة البطنية الأخيرة من اليرقات باستخدام ملقط ساعات. ارفع القشيرة من جثة اليرقة، ثم اصنع شقاً على طول الجثة باستخدام مقص. احرص على عدم تمزيق الأمعاء.

أثناء إجراء الشق، قم بعزل نسيج المعى المتوسط بعناية عن الأنسجة الأخرى مثل الأجسام الدهنية والأنسجة الضامة. ثم اشطف النسيج باستخدام محلول XPBS المنظم بتركيز 1x طازج للتأكد من عدم وجود تلوث بالأجسام الدهنية. انقل المعى المتوسط إلى 500 µL من كاشف triol المبرد مسبقاً في أنبوب eend orph سعة 1.5 mL.

بعد ذلك، اعزل نسيج الجسم الدهني باستخدام ملقط وانقله إلى أنبوب eend orph سعة 1.5 milliliter يحتوي على 500 microliters من كاشف triol المبرد. وأخيرًا، اعزل نسيج القشيرة من جثة اليرقة عن طريق كشط أي أنسجة ملتصقة، مع الحرص على عدم الإضرار بسلامة الأنسجة.

اشطف نسيج القشيرة المعزول في محلول PBS المنظم الطازج وانقله إلى أنبوب eend orph سعة 1.5 milliliter يحتوي على 500 microliters من كاشف التريازول المبرد. يمكن تخزين أنسجة الجسم الدهني والقشيرة والمعي المتوسط المعزولة عند درجة حرارة minus 80 degrees Celsius حتى يتم استخلاص RNA. وتحضيراً لاستخلاص RNA، قم بفرز عينات EAB المختلفة وفقاً للمراحل التنموية.

تشمل هذه المراحل الأولى، والثانية، والثالثة، والرابعة في النجوم، وPrepU، والبالغين. لبدء استخلاص RNA، استخدم أولاً مدقات بلاستيكية لمجانسة الأنسجة في أنابيب einor سعة 1.5 milliliter تحتوي على triol. بعد التجانس، اجعل الحجم الإجمالي لكل عينة مليون ملليلتر باستخدام كاشف triol.

بالنسبة لمراحل النمو، قم بتجنيس الحيوان كاملاً في النيتروجين السائل باستخدام الهاون والمدقة. بعد ذلك، أضف جزءاً من المتجانس إلى 1 ml من التريول. قم بحضن أنابيب العينات مع 1 ml من التريول لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد التحضين، أضف 200 µL من الكلوروفورم إلى كل أنبوب فوراً. رُجّ الأنابيب بقوة لمدة 15 ثانية تقريباً. ثم حضّن الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق إضافية.

بعد ذلك، قم بطرد العينات مركزياً عند 12,000 GS لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 2 °C. وبعد عملية الطرد المركزي، سيكون الـ RNA في الطور المائي. ويجب أن يكون حجم الطور المائي 600 µL أو 60% من إجمالي حجم التريول.

قم بإزالة الطور المائي فقط بعناية. إذ إن وجود أي مواد أسفل الطور المائي سيؤدي إلى تلوث الـ RNA المستخلص. ثم انقل الطور المائي إلى أنبوب إبيندورف سعة 1.5 milliliter مميز بملصق مناسب.

لترسيب الـ RNA من خليط الطور المائي، أضف 0.5 milliliters من كحول الإيزوبروبيل إلى كل أنبوب. تُحضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. وبعد التحضين، تُطرد الأنابيب مركزياً عند 12, 000 Gs لمدة 10 دقائق عند درجتين مئويتين (2 °C). وعقب عملية الطرد المركزي، يتم التخلص من سائل الـ S natin من الأنابيب.

يتواجد الـ RNA في الراسب الشبيه بالهلام المتكون في قاع الأنبوب. اغسل الراسب باستخدام 75%ethanol، مع إضافة ملي لتر واحد على الأقل من 75%ethanol لكل ملي لتر واحد، ثم اخلط المزيج بواسطة جهاز الـ vortexing. بعد ذلك، قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 7,500 G لمدة خمس دقائق عند درجتين مئويتين 2 °C.

تخلص من السائل الطافي من الأنابيب. قم بطرد مركزي للأنابيب مرة أخرى في جهاز الطرد المركزي الطاولى الصغير لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة أي سائل طافٍ زائد من الأنبوب عن طريق السحب الدقيق بالماصة.

اترك الأنبوب مفتوحاً واترك الراسب ليجف في الهواء لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق. كن حريصاً على عدم تجفيف الراسب بشكل مفرط لأن ذلك سيقلل بشكل كبير من قابليته للذوبان بعد التجفيف الهوائي. أعد تعليق الراسب في diethyl pyrocarbonate أو في الماء المعالج بـ DEPC.

تعتمد كمية الماء المستخدمة لإعادة تعليق الراسب على حجم الراسب. استخدم 50 µL من الماء المعالج (dep sea treated water) للراسب الصغير أو 100 µL للراسب الكبير. اترك الراسب يذوب تماماً في الماء المعالج عن طريق تحريك رأس الماصة للأعلى والأسفل عدة مرات.

بمجرد ذوبان الراسب، ضع العينة عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم قم بقياس تركيز كل عينة RNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop. وأخيراً، قم بإجراء تخليق الشريط الأول من cDNA لعينات RNA المعنية باستخدام نظام Invitrogen SuperScript لتخليق الشريط الأول لـ RT-PCR.

يمكن العثور على هذا الإجراء في الجزء المكتوب من هذا البروتوكول. لبدء تصميم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (Q-R-T-P-C-R)، صمم كل بادئ بحيث تكون درجة حرارة الانصهار 60 °C وحجم الناتج 100 base pairs تقريبًا. يُستخدم AP par one كجين مستهدف في هذه التجربة.

يلزم وجود جين مرجعي أو ضابط داخلي من أجل التحليل اللاحق ومعايرة البيانات. هنا، تم استخدام البروتين الريبوسومي a P RRP one كجين مرجعي. بعد ذلك، صمم نموذجاً يوضح اسم العينة لكل بئر ولوحة QR tpcr.

تذكر تضمين معايير لكل جين ومكررات تقنية اثنين على الأقل لكل عينة. بعد ذلك، قم بتشغيل جهاز QRT PCR وأدخل معاملات الدورات لتهيئة اللوحة لجهاز CFX 96. أولاً، قم بتحضير المزيج الرئيسي (master mix) لكل جين في أنبوب منفصل لكل بئر.

يتكون المزيج الرئيسي (master mix) من 2 µL من الماء الخالي من النوكلياز، و4 µL من 2.5 x cyber green، و1 µL من البادئ الأمامي (primer forward)، و1 µL من البادئ العكسي (primer reverse)، ليصل الحجم الإجمالي إلى 8 µL. وفقاً للقالب المصمم مسبقاً، يتم إضافة 2 µL من cDNA إلى كل بئر، ثم تضاف 8 µL من المزيج الرئيسي إلى كل بئر، مما ينتج عنه حجم إجمالي قدره 10 µL لكل تفاعل. يتم السحب والضخ بالماصة (pipette up and down) لضمان خلط العينة جيداً.

تأكد من عدم بقاء أي سائل على رأس الماصة. ولتجنب التلوث الخلطي، استخدم رأس ماصة جديداً لكل عينة. وبمجرد تجهيز الصفيحة بالكامل، قم بتغطيتها بشريط لاصق بصري.

تجنب لمس الشريط لأن وجود الدهون قد يؤثر على القراءة. بعد ذلك، قم بطرد اللوح مركزياً بسرعة 500 RPM لمدة دقيقة واحدة لضمان استقرار جميع النواتج في قاع الآبار بعد عملية الطرد المركزي. تحقق من عدم وجود ثلج أو ماء في قاع اللوح.

وأخيراً، ضع الطبق في جهاز QR TPCR وقم بتشغيل برنامج PCR؛ تظهر هنا النتائج النموذجية ليرقات EAB. يتم عرض عملية التشريح و QR TPCR هنا. يجب أن يكشف تشريح يرقات EAB عن المعي المتوسط في منتصف اليرقة EAB.

يتم عزل المعي المتوسط ليرقة EAB كما هو موضح هنا، وتظهر هنا قيم التعبير النسبي المتوسطة أو RAVs. يظهر هنا التعبير عن جين para trophin AP par one في أنسجة يرقية مختلفة، بما في ذلك القشيرة، والمعي المتوسط، والأجسام الدهنية. استُخدم البروتين الريبوسومي ARP one الخاص بـ EAB كضابط داخلي لمعايرة البيانات التي تم الحصول عليها للجين المستهدف.

تم استخلاص التغير النسبي في طيات التعبير لـ AP AP par one في أنسجة يرقانية مختلفة. وأظهرت أنسجة القشيرة (cuticle) أدنى مستوى تعبير، لذا اعتُمدت كعينة معايرة لمتوسط القيم النسبية لـ AP Perry. One في مراحل نمو مختلفة لـ EAB، بما في ذلك الأعمار اليرقية الأولى والثانية والثالثة والرابعة.

تم تحديد مستويات PrepU والبالغين باستخدام aprp one كضابط داخلي لمعايرة البيانات. كما تم تحديد التغير النسبي في طيات تعبير AP Perry one لمراحل نمو مختلفة. وفي هذه الحالة، أظهرت عينة PrepU أدنى مستوى من mRNA، وبناءً عليه تم اتخاذها كمعاير.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء التشريحات الجانبية، ومن ثم تحليل التعبير الجيني باستخدام الجزء الجانبي، بالإضافة إلى مراحل نمو مختلفة من Emeral ra باستخدام تقنية quantitative R-T-P-C-R أثناء تنفيذ هذا الإجراء. يجب توخي الحذر أثناء التشريح لتجنب التلوث الخلطي لعينات الأنسجة. كما يجب الحرص عند إجراء Q-R-T-P-C-R لضمان نقل العينات المحددة إلى أنبوب PCR المخصص لها باستخدام الماصة.

هذا كل شيء. شكراً لمشاهدة الفيديو الخاص بنا، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.