تحليل التعبير الجيني في الحفار الرماد الزمرد ( Agrilus planipennis) عن طريق ريال الكمية من الزمن - PCR

الهدف العام من التجربة التالية هو تحليل التعبير الجيني في أنسجة ومراحل نمو حشرة خنفساء الرماد الزمردية باستخدام تقنية PCR الكمية. ويتم تحقيق ذلك من خلال تشريح أنسجة اليرقات وتصنيف مراحل النمو. وكخطوة ثانية، يتم استخلاص RNA من الأنسجة ومراحل النمو باستخدام كاشف triol، والذي يُستخدم بعد ذلك كقالب لتوليد الشريط الأول، cDNA، وبعد تخليق الشريط الأول من cDNA، يتم إجراء quantitative RT-PCR.

تم الحصول على نتائج تُظهر تعبيراً تفاضلياً للجين المستهدف في أنسجة يرقية ومراحل نمائية مختلفة، وذلك بناءً على بيانات التغير الكاملة المستمدة من قيم عتبة الدورة بعد تضخيمات R-T-P-C-R الكمية. مرحباً، أنا براكاش مي، الباحث الرئيسي لهذا المختبر في قسم علم الحشرات بجامعة ولاية أوهايو.

يركز مختبري بشكل أساسي على الجوانب الجينومية أو الجزيئية للتفاعلات بين حشرة خنافس الرماد الزمردية والرماد. وتعد خنافس الرماد الزمردية (EAB) آفة غازية دخيلة من الصين وتهدد وجود مجموعات الرماد في جميع أنحاء أمريكا الشمالية. سنعرض لكم اليوم بروتوكولاً لتعلم تحليل التعبير الجيني في EAB باستخدام QPCR أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي.

أعضاء المختبر الذين سيشاركون في هذا البروتوكول هم Swapna pri ou، التي ستقوم بعمليات تشريح الـ val، ثم ستقوم bin Bandari بعرض عملية عزل الـ RNA. وأخيرًا، ستقوم Lauren Rivera Vega بإجراء تحليل QPC. كما نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التعبير الجيني لـ ash.

لنبدأ الآن. قبل البدء في هذا الإجراء، ضع يرقات خنفساء رماد الزمرد أو EAD على ورق مناديل مبلل. وحتى يتم إجراء عمليات التشريح، احتفظ بمحلول ملحي منظم بالفوسفات بتركيز 1x أو PBS المُعد حديثاً على الثلج للحفاظ على برودة المحلول المنظم طوال عملية التشريح.

للبدء، قم بتثبيت يرقات EAB على لوحة التشريح باستخدام دبابيس تشريح دقيقة. ثم أضف cold one XPBS إلى لوحة التشريح. أولاً، قم بقطع رأس اليرقات باستخدام مقص تشريح دقيق.

بعد ذلك، قم بإزالة القطعة البطنية الأخيرة من اليرقات باستخدام ملقط ساعات. ارفع القشيرة عن جثة اليرقة، ثم قم بعمل شق طولي على طول الجثة باستخدام مقص. احرص على عدم تمزيق الأمعاء.

أثناء إجراء الشق، قم بعزل أنسجة المعي المتوسط بعناية عن الأنسجة الأخرى مثل الأجسام الدهنية والأنسجة الضامة. بعد ذلك، اشطف النسيج في محلول منظم 1X PBS طازج للتأكد من عدم وجود تلوث من الأجسام الدهنية. انقل المعي المتوسط إلى 500 µL من كاشف triol المبرد مسبقاً في أنبوب eend orph سعة 1.5 mL.

بعد ذلك، يتم عزل نسيج الجسم الدهني باستخدام الملاقط ونقله إلى أنبوب eend orph سعة 1.5 milliliter يحتوي على 500 microliters من كاشف triol المبرد. وأخيراً، يتم عزل نسيج القشيرة من جثة اليرقة عن طريق كشط أي أنسجة ملتصقة، مع الحرص على عدم الإضرار بسلامة النسيج.

اشطف نسيج القشيرة المعزول في محلول PBS المنظم الطازج وانقله إلى أنبوب eend orph سعة 1.5 milliliter يحتوي على 500 microliters من كاشف التريازول المبرد. يمكن تخزين أنسجة الجسم الدهني والقشيرة والمعي المتوسط المعزولة في درجة حرارة minus 80 degrees Celsius حتى يتم استخلاص RNA. وتحضيراً لاستخلاص RNA، قم بفرز عينات EAB المختلفة وفقاً لمراحل النمو.

تشمل هذه المراحل الأولى والثانية والثالثة والرابعة في النجوم، وPrepU، والبالغين. لبدء استخلاص RNA، استخدم أولاً مدقات بلاستيكية لتجنيس الأنسجة في أنابيب einor سعة 1.5 milliliter تحتوي على triol. بعد التجنيس، يتم إكمال الحجم الإجمالي لكل عينة إلى one milliliter باستخدام كاشف triol.

بالنسبة لمراحل النمو، قم بتجنيس الحيوان كاملاً في النيتروجين السائل باستخدام هاون ومدقة. ثم أضف كمية مقدرة من المستجنس إلى ملليلتر واحد من triol. قم بحضن أنابيب العينات مع ملليلتر واحد من triol لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحضن، أضف 200 µL من الكلوروفورم إلى كل أنبوب فوراً. رج الأنابيب بقوة لمدة 15 ثانية تقريباً. ثم احضن الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق إضافية.

بعد ذلك، قم بطرد العينات مركزياً عند 12,000 GS لمدة 15 دقيقة عند درجتين Celsius. بعد عملية الطرد المركزي، سيكون الـ RNA في الطور المائي. يجب أن يكون حجم الطور المائي 600 µL أو 60% من إجمالي حجم التريول.

قم بإزالة الطور المائي فقط بعناية. حيث إن وجود مواد أسفل الطور المائي سيؤدي إلى تلوث الـ RNA المستخلص. بعد ذلك، انقل الطور المائي إلى أنبوب einor سعة 1.5 milliliter مُصنف بشكل مناسب.

لترسيب الـ RNA من خليط الطور المائي، أضف 0.5 milliliters من كحول الإيزوبروبانول إلى كل أنبوب. تُحضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد التحضين، تُطرد الأنابيب مركزياً عند 12,000 Gs لمدة 10 دقائق عند درجتين Celsius. عقب عملية الطرد المركزي، يتم التخلص من الـ S natin من الأنابيب.

يتواجد الـ RNA في الراسب الشبيه بالهلام المتكون في قاع الأنبوب. اغسل الراسب باستخدام 75%ethanol، مع إضافة 1 mL على الأقل من 75%ethanol لكل 1 mL من الخليط، ثم اخلط المزيج باستخدام جهاز vortexing. بعد ذلك، قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 7,500 G لمدة خمس دقائق عند درجتين Celsius.

تخلص من السائل الطافي من الأنابيب. قم بطرد مركزي للأنابيب مرة أخرى في جهاز الطرد المركزي المكتبي الصغير لمدة دقيقة واحدة. أزل أي سائل طافي زائد من الأنبوب باستخدام الماصة بعناية.

اترك الأنبوب مفتوحاً واترك الراسب يجف في الهواء لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق. احرص على عدم تجفيف الراسب بشكل مفرط لأن ذلك سيقلل من قابليته للذوبان بشكل ملحوظ بعد التجفيف الهوائي. أعد تعليق الراسب في dathyl percarbonate أو ماء منزوع الأيونات ومعالج.

تعتمد كمية الماء المستخدمة لإعادة تعليق الراسب على حجم الراسب. استخدم 50 µL من المياه المعالجة لـ dep sea للراسب الصغير أو 100 µL للراسب الكبير. اترك الراسب يذوب تماماً في المياه المعالجة لـ dep sea عن طريق تحريك طرف الماصة للأعلى وللأسفل عدة مرات.

بمجرد ذوبان الراسب، ضع العينة عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم قم بقياس تركيز كل عينة RNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop. وأخيراً، قم بإجراء تخليق الشريط الأول من cDNA لعينات RNA المعنية باستخدام نظام Invitrogen SuperScript لتخليق الشريط الأول لـ RT-PCR.

يمكن العثور على هذا الإجراء في الجزء المكتوب من هذا البروتوكول. لبدء تصميم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (Q-R-T-P-C-R)، صمم كل بادئ ليكون له درجة حرارة انصهار تبلغ 60 °C وحجم ناتج يبلغ 100 base pairs تقريباً. يُستخدم AP par one كالجين المستهدف في هذه التجربة.

من الضروري وجود جين مرجعي أو ضابط داخلي لإجراء التحليلات اللاحقة ومعايرة البيانات. وفي هذه التجربة، يُستخدم البروتين الريبوسومي a P RRP one كجين مرجعي. بعد ذلك، قم بتصميم مخطط يوضح اسم العينة لكل بئر في لوحة الـ QR tpcr.

تذكر تضمين معايير لكل جين ومكررات تقنية اثنين على الأقل لكل عينة. ثم قم بتشغيل جهاز QRT PCR وأدخل معاملات الدورات لإعداد اللوحة لجهاز CFX 96. أولاً، قم بتحضير المزيج الرئيسي (master mix) لكل جين في أنبوب منفصل لكل بئر.

يتكون المزيج الرئيسي (master mix) من 2 µL من الماء الخالي من النوكلييز، و4 µL من 2.5 x cyber green، و1 µL من البادئ الأمامي (primer forward)، و1 µL من البادئ العكسي (primer reverse)، ليصبح الحجم الإجمالي 8 µL. وفقاً للقالب المصمم مسبقاً، أضف 2 µL من CDNA إلى كل بئر، ثم أضف 8 µL من المزيج الرئيسي إلى كل بئر، مما ينتج عنه حجم إجمالي قدره 10 µL لكل تفاعل. استخدم الماصة للسحب والدفع (pipette up and down) لضمان مزج العينة جيداً.

تأكد من عدم بقاء أي سائل على طرف الماصة. ولتجنب التلوث الخلطي، استخدم طرفاً جديداً لكل عينة. وبمجرد الانتهاء من إعداد اللوحة بالكامل، قم بتغطيتها بشريط لاصق بصري.

تجنب لمس الشريط لأن وجود الدهون قد يؤثر على القراءة. بعد ذلك، قم بطرد الطبق مركزياً بسرعة 500 RPM لمدة دقيقة واحدة لضمان استقرار جميع النواتج في قاع آبار الطبق بعد عملية الطرد المركزي. تحقق من عدم وجود جليد أو ماء في قاع الطبق.

أخيراً، ضع الطبق في جهاز QR TPCR وقم بتشغيل برنامج PCR الذي يمثل النتائج الخاصة بيرقات EAB. تظهر هنا عملية التشريح وQR TPCR. يجب أن يكشف تشريح يرقات EAB عن المعي المتوسط في منتصف يرقة EAB.

يتم عزل المعي المتوسط ليرقة Xylosandrucus clavipes كما هو موضح هنا، وتظهر هنا قيم التعبير النسبي المتوسط أو RAVs. وبالنسبة لجين الباراتروفين AP par one، تظهر النتائج هنا لأنسجة يرقية مختلفة، بما في ذلك القشيرة والمعي المتوسط والأجسام الدهنية. وقد استُخدم البروتين الريبوسومي الخاص بـ Xylosandrucus clavipes والمسمى ARP one كضابط داخلي لمعايرة البيانات التي تم الحصول عليها للجين المستهدف.

تم استخلاص التغير النسبي في طي تعبير AP AP par one لمختلف أنسجة اليرقات. وأظهر نسيج القشيرة أقل مستوى تعبير، وبناءً عليه فقد تم اعتباره عينة المعايرة لمتوسط القيم النسبية (RVs) لـ AP Perry. One في مراحل نمو مختلفة لـ EAB، بما في ذلك الأعمار اليرقية الأولى، والثانية، والثالثة، والرابعة.

تم تحديد مستويات PrepU والبالغين باستخدام aprp one كضابط داخلي لتقييس البيانات. وتم تحديد التغير النسبي في طيات AP Perry one لمختلف المراحل التنموية. وفي هذه الحالة، أظهرت عينة PrepU أدنى مستوى من mRNA، وبالتالي تم اعتمادها كمعيار للمعايرة.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء التشريحات الجانبية ومن ثم تحليل التعبير الجيني باستخدام الجانب، بالإضافة إلى مراحل نمو مختلفة لـ Emeral ra باستخدام تقنية quantitative R-T-P-C-R أثناء تنفيذ هذا الإجراء. يجب توخي الحذر أثناء التشريح لتجنب التلوث الخلطي لعينات الأنسجة. كما يجب الحرص عند إجراء Q-R-T-P-C-R لضمان نقل العينات المناسبة إلى أنابيب PCR المخصصة لها باستخدام الماصة.

هذا كل شيء. شكراً لمشاهدتكم الفيديو الخاص بنا، وبالتوفيق في تجاربكم.