التوسيم وخلايا الدماغ المؤخر التصوير في اسماك الزرد

الهدف العام من التجربة التالية هو تصوير الخلايا العصبية بدقة عالية في جنين سمكة الزيبرا. أولاً، يتم حقن الحمض النووي DNA الذي يشفر البروتين الفلوري الأخضر المستهدف للغشاء في جنين سمكة الزيبرا في مرحلة الخلية الواحدة، مما يؤدي إلى وراثة فسيفسائية، وهو ما يسمح بتحسين تصوير الخلايا المشتتة. بعد ذلك، يتم وسم الأجنة مناعياً باستخدام anti GFP وتقطيعها إلى شرائح، مما يتيح تصور مورفولوجيا الخلايا المفردة بدقة عالية في تحضير مثبت. وبدلاً من ذلك، يمكن فحص الأجنة الحية باستخدام مجهر الفيديو التصويري المتقطع (time-lapse video microscopy) لتصوير الديناميكيات الخلوية.

تُستخلص النتائج التي توضح مورفولوجيا الخلايا أو ديناميكيتها. هنا، يتم تصوير الدماغ الخلفي لسمكة الزيبرا باستخدام المجهر البؤري. مرحباً بالجميع.

أنا بي آر تشاندران من مختبر الدكتورة راشيل بروستر في قسم العلوم البيولوجية بجامعة ميريلاند بالتمور كاونتي. سنعرض لكم اليوم إجراءً لوسم وتصوير الخلايا العصبية في جنين سمكة الزيبرا بدقة عالية. عادةً ما نستخدم هذا الإجراء في المختبر لدراسة آليات التجدد العصبي في جنين سمكة الزيبرا على المستوى الخلوي.

لنبدأ الآن. ضع مناديل Kim wipes مبللة حول حافة طبق بتري بقطر 100 مليمتر.

ثبّت إبرة حقن مجهرية زجاجية بعناية على شريط من الشمع داخل الطبق المرطب. وباستخدام مجهر تشريحي ستيريوسكوبي، قم بمحاذاة الإبرة مقابل شريحة مدرجة. وللحصول على طرف بالحجم المناسب، استخدم شفرة حلاقة نظيفة للنقر برفق على الإبرة عند النقطة التي يبلغ قطرها 1 µm.

قم بتوصيل الإبرة بـجهاز الحقن المجهري، وضع 0.5 µL من محلول الفينول الأحمر والماء على غشاء البارافيلم، ثم املأ الإبرة من القطرات. اضبط ضغط الحقن المجهري على 7 kPa وابدأ بنبضة مدتها 20 ms. قم بعدد النبضات اللازمة لتفريغ كل السائل. قم بتغيير الوقت بين 10 و30 ms بحيث يستغرق التفريغ 250 نبضة تقريبًا.

0.5 µL من المحلول. استخدم ماصة دقيقة لملء الإبرة عكسياً من 0.5 إلى 1 µL من MG FPD NA في الماء، مخلوطاً بـ phenol red للتصور. قم بتغطية الطبق المرطب لمنع تبخر المحلول من الإبرة تحت المجهر المجسم.

ضع أجنة الأسماك في مرحلة الخلية الواحدة بشكل منفصل في طبق بتري بقطر 60 مليمتر مملوء بـ embryo.Medium. استخدم ملقطاً دقيقاً للإمساك بالغشاء الكوريوني برفق وتثبيت الجنين. حرك الإبرة المملوءة بـ MGFP و phenol red إلى المنطقة المستهدفة للحقن.

للتعبير الواسع عن MGFP، يتم الحقن في المح، أو في السيتوبلازم. استخدم جهاز الحقن المجهري لحقن حوالي 2 nanoliters من محلول MGFP. راقب موقع مؤشر الفينول الأحمر للتأكد من إتمام عملية الحقن بشكل صحيح.

أخرج الإبرة بعناية من الجنين. قم بحقن جميع الأجنة في الطبق، بما يصل إلى 30 جنيناً في المرة الواحدة. تجنب تعريض الأجنة للضوء، واحفظها في الحاضنة عند درجة حرارة 28.5 °C للسماح للأجنة بالنمو حتى المرحلة المطلوبة تحت المجهر المجسم.

استخدم ملقطاً دقيقاً لإزالة غلاف الكوريان بلطف عن الأجنة. واستخدم ماصة باستا لإزالة غلاف الكوريان الفارغ من الطبق، مع الإبقاء فقط على الأجنة المغلفة بـ dec. استخدم ماصة باستا مصقولة بالنار لنقل الأجنة المغلفة المحقونة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter.

قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط الزائد، ثم أضف واحد milliliter من ative. اغسل الأجنة في محلول 1X PBS بدرجة حرارة الغرفة 3 مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة. انقل الأجنة إلى طبق بتري مملوء بمحلول 1X PBS تحت المجهر الستيريو.

استخدم ملقطًا دقيقًا للإمساك بالجنين بالقرب من منطقة الذيل. استخدم مجموعة ثانية من الملاقط أو أداة تحريك لمحاولة إزالة أكبر قدر ممكن من الـ yo دون لمس منطقة الإطار الخلفي. أثناء النظر عبر المجهر المجسم، استخدم الملقط الدقيق لرفع الجنين من الطبق ووضعه في قالب تقطيع مملوء بـ 4%low melting point.Aros.

ضع الجنين باتجاه أحد طرفي القالب. اترك مادة aros تتصلب في درجة حرارة الغرفة. استخدم ملعقة مسطحة لإزالة كتلة aros المتصلبة من القالب، وبواسطة شفرة مرفوعة، اقطع الطرف السفلي للكتلة بشكل مستوٍ.

استخدم قطرة من الغراء الفائق لتثبيت الكتلة على منصة الاهتزاز بحيث يكون الجانب المقطوع لأسفل إذا رغبت في ذلك. قم بمحاذاة عدة كتل على المنصة، ثم قم بتثبيت المنصة في جهاز الاهتزاز.

تأكد من أن الشفرة ستقطع كل جنين بالكامل، ولكن دون أن تخترق الكتلة كلياً. املأ المنصة بقسم واحد من XPBS. اقطع الأجنة بعناية إلى خلفية كتلة واحدة وانقلها إلى طبق بتري مملوء بـ XPBS واحد.

افصل المقاطع تحت المجهر الستيريو. استخدم ملقطاً دقيقاً لوضع المقاطع المطلوبة في طبق متعدد الفجوات مملوء بـ 1x PBS. استخدم فجوة مختلفة لكل جنين.

صَبغ المقاطع باستخدام DPI والوسم المناعي باستخدام anti GFP. وإلا، يتم التصوير خلال 48 ساعة. ثبّت ما يصل إلى ستة مقاطع في كل شريحة وضع غطاءً زجاجياً فوق المقاطع من أجل التصوير المجهري البؤري.

تُحفظ الشرائح في الظلام لتجنب التبييض الضوئي. وفيما يخص التصوير الحي، يجب حماية الأجنة المحقونة بـ MGFP من الضوء. استخدم الملاقط لجمع الأجنة قبل 30 دقيقة من وصولها إلى المرحلة التطورية المطلوبة.

انقل الأجنة المغلفة إلى محلول مهدئ من وسط الأجنة يحتوي على 0.01%Trica واحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. باستخدام الماصة، ضع قطرة من 1%regular arose في الماء على طبق زراعة زجاجي القاع بقطر 35 مليمتر بحيث يملأ القالب. اترك الـ agros ليتصلب.

استخدم أنبوب شعري زجاجي بطول 90 مليمتر لعمل ثلاث ثقوب في قطرة aros تحت المجهر الستيريو. افحص قاع البئر وأزل أي بقايا من aros باستخدام الملاقط. املأ الطبق بوسط الأجنة تحت المجهر الستيريو.

استخدم ماصة باستور لنقل جنين واحد إلى كل ثقب في الأروس. استخدم ملقطاً دقيقاً لتوجيه الجنين بحيث تكون المنطقة المراد فحصها، وفي هذه الحالة الرأس الظهري، مستندة إلى الزجاج. غطِّ الطبق.

انقل الطبق بعناية إلى منصة مجهر كونفوكالي. استخدم سخانات المساحة للحفاظ على الأجنة عند درجة حرارة 28.5 درجة مئوية طوال فترة التصوير. يظهر هنا مقطع عرضي عبر الدماغ الخلفي لجنين من النوع البري في مرحلة أربعة إلى خمسة جسيدات، مصبغ بصبغتين: GFP المستهدف للغشاء باللون الأخضر وD باللون الأزرق؛ حيث تم وسم خلية واحدة فقط بـ GFP المرتبط بالغشاء، مما يسمح بتصوير عالي الدقة للشكل المورفولوجي والتنظيم الخلوي.

هذه صورة مقارنة للدماغ الخلفي لطفرة nardi في مرحلة من أربع إلى خمس قطع جسدية. وتكشف هذه الصورة أن الخلايا في طفرات nardi تفشل في التوجه بشكل صحيح نحو الخط المتوسط أثناء التطور العصبي. وعلى عكس طريقة وسم الخلايا باستخدام MGFP، فإن وسم الدماغ الخلفي بعلامة عامة لسطح الخلية مثل beta-catenin لا يسمح بتصور مورفولوجيا الخلايا الفردية.

يكشف التصوير المسرّع للزمن للدماغ الخلفي لجنين مُوسوم بـ MG FP أن السلوكيات الخلوية التي تحرك التشكل العصبي في سمك الزيبرا ديناميكية للغاية وتتضمن تمدد النتوءات الغشائية أثناء هجرة الخلايا وتداخلها. لقد أوضحنا لكم للتو كيفية تحضير أجنة سمك الزيبرا، سواء المثبتة منها أو الحية، للتصوير أحادي الخلية بدقة عالية. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.