Name: التوسيم وخلايا الدماغ المؤخر التصوير في اسماك الزرد (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: اكتشف تقنية تصوير عالي الدقة لخلايا الدماغ في أجنة أسماك الزرد باستخدام البروتين الفلوري المستهدف للغشاء. تتيح هذه الطريقة مراقبة ديناميكيات الخلايا الفردية ودراسة عمليات التشكل الحيوي أثناء التطور الجنيني.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل عن طريق منحة المعاهد الوطنية للصحة التي منحت لبروستر R. (1R01GM085290 - 01A1).

1.Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع بلازميد ترميز الغشاء الذي يستهدف البروتين الأخضر نيون (mGFP ، من باب المجاملة هارلاند ريتشارد) إلى تركيز 40 نانوغرام / مل. أعد بواسطة الحمض النووي linearizing البلازميد (mGFP/PCS2 + ، من باب المجاملة هارلاند ريتشارد) تنقية باستخدام الإعدادية ماكسي Qiagen كيت. ويفضل إضافة أحمر الفينول (مخفف 10/01 الحجم الكلي) إلى حل لتصور الحل. الحل إبقاء الحمض النووي على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت stereomicroscope ، معايرة إبرة الحقن (ضربات 90mm الزجاج من الشعيرات الدموية العلمية Narishinge ؛ القط رقم NA - GD - 1) عن طريق مواءمة الإبرة على شريحة تخرج والتنصت بلطف جزءا من الإبرة حيث القطر 1μm باستخدام شفرة حلاقة نظيفة شفرة (للحصول على معلومات سرية من الحجم المناسب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل معايرة إبرة لحقن حجم المعروفة (2nl) ، وربط الإبرة إلى الأجهزة microinjection (PCI 100 Microinjector ؛ جهاز هارفارد) ، والجبهة ملء الإبرة مع 0.5μl من محلول يحتوي على أحمر الفينول والماء وضعها على قطعة من البارافين. ويمكن الاستغناء عن حل باستخدام دواسة القدم. ضبط ضغط الجيش الشعبي الكوري إلى 7 وتختلف الوقت (10msec 30msec) بحيث يستغرق 250 الدواسات الاستغناء 0.5μl من الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية مكان الإبرة معايرة على شريط من الشمع في ترطيب 100 مم طبق بتري. لترطيب الطبق ، ومكان Kimwipes الرطب حول حواف (وهذا يمنع التبخر من الحل في الإبرة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام micropipette لتحميل 0.5 1μl من الحمض النووي في نهاية الإبرة (النهاية التي لم تكن محسوبة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن وصلت إلى حل غيض الإبرة ، وربط نهاية الإبرة التي كانت تستخدم لتحميل لجهاز microinjection. ضبط الإعدادات على microinjector لتقديم ما يقرب من 2 NL / الحقن باستخدام دواسة القدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القادم الزرد موقف والأجنة في وسط طبق بيتري مليئة متوسطة الأجنة (ألبوم 1.0 مل هانك # 1 ، 0.1 مل هانك الاسهم # 2 ، ألبوم 1.0 مل هانك في رقم 4 ، 95.9 مل DDH 2 O ، ألبوم 1.0 مل هانك و# 5 ، ألبوم 1.0 مل الطازجة وهانك # 6 ، استخدم حوالي 10 قطرات هيدروكسيد الصوديوم M 1 إلى 7.2 درجة الحموضة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في طور الأجنة إلى مرحلة المرجوة ، وقبضة بلطف المشيماء بالملقط الجميلة وضعه الإبرة في المنطقة المستهدفة عن طريق الحقن. لمجموعة واسعة التعبير mGFP ، وضخ الحمض النووي في صفار البيض أو السيتوبلازم في المرحلة 1cell. لتقييد حرية التعبير من mGFP إلى أصغر والمنطقة ، وحقن الحمض النووي في 4 (أو أكثر) مرحلة الخلايا إلى السيتوبلازم من خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على دواسة القدم لجهاز microinjection وتقديم ما يقرب من 2 NL ، وضمان أن يتم حقن صحيح الحل (مرئية بسبب إضافة أحمر الفينول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الإبرة بعناية من الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكرر للجميع الأجنة في صحن بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لتطوير اجنة في 28.5 درجة مئوية إلى المرحلة المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate الأجنة بواسطة التقشير بلطف قبالة المشيماء باستخدام الملقط غرامة (إذا كان أصغر سنا من أجنة 24hpf ، dechorionating في طبق بتري الزجاج يزيد من معدل بقاء الأجنة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المشيماء فارغة من طبق بيتري باستخدام ماصة الزجاج. </li></ol> 2. التصوير mGFP المسمى المقاطع vibratome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة الزجاج لنقل الأجنة في بارافورمالدهيد (4 ٪ تثبيتي في 1X الفوسفات حل العازلة (PBS). فيكس الأجنة عند 4 درجات مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأجنة في برنامج تلفزيوني 1X 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأجنة في طبق بتري و، وذلك باستخدام ملقط غرامة ، وإزالة صفار دون الإضرار بالجنين. إزالة صفار قدر الإمكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 4 ٪ منخفضة ذوبان agarose في H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان agarose المصهور الى قالب من البلاستيك sectioning. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لرفع الغرامة حقن الجنين من طبق بيتري ، ووضع وتوجيه في agarose. ينبغي وضع الجنين نحو نهاية واحدة من العفن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد تصلب agarose ، استخدم أداة سطح مستو ، مثل ملعقة ، لإزالة كتلة agarose من العفن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض الحد الادنى من كتلة agarose بشفرة الحلاقة بحيث يكون أكبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة من الصمغ السوبر إلى مرحلة vibratome ومكان كتلة agarose على ذلك (إلى جانب الكتلة التي كان استقر مع أسلاك شائكة ينبغي مواجهة الغراء). لsectioning أجنة متعددة ، يشن عدة agarose جزءا لا يتجزأ من العينات على المسرح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق المرحلة vibratome إلى vibratome (Vibratome ، وشركة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المعلمات من vibratome (إعدادات الشائعة : سرعة 3 ؛ سماكة - 50μm). إذا sectioning أجنة متعددة ، محاذاة كتل agarose على المسرح والتأكد من أن نصل يمر الجنين كلها ولكن ليس من خلال عرض كامل للكتل agarose (مثل تلك المقاطع المقابلة لنفس جنين ستبقى معا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 1X PBS في المرحلة vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في الأجنة التقطيعةنيد ، إزالة كتلة agarose (ق) من المرحلة vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منفصلة بعناية كل قسم عن طريق قطع الجزء الخلفي من كتلة agarose (ق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط غرامة لتحديد الأجزاء المطلوبة والمكان الى صحن 1X متعددة مملوءة جيدا PBS (استخدام الآبار مختلفة عن الأجزاء المقابلة لأجنة مختلفة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر لكل الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في وضع العلامات الأضداد ، على الرغم من الخطوات 19 23 ، لتعزيز mGFP التصوير (هذه الخطوة قد لا يكون ضروريا إذا كانت المقاطع المصورة في غضون يوم أو يومين من الإعداد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام علاج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الحل حظر في برنامج تلفزيوني 1X إلى كتلة غير محددة وملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المقاطع مع الأجسام المضادة الأولية (أرنب ، GFP ، Invitrogen القط رقم A11122) المخفف @ 1:200 في حل حظر على شاكر لمدة 5 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أربع مرات (10 دقيقة ، 15 دقيقة ، 30 دقيقة و 60 دقيقة ، ولكل منهما) في 1 ٪ BSA/1X PBS / 1 ٪ حل DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الأجسام المضادة الثانوية مع أقسام مناسبة في حل حظر لمدة 5 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أربع مرات (10 دقيقة ، 15 دقيقة ، 30 دقيقة و 60 دقيقة ، ولكل منهما) في 1 ٪ BSA/1X PBS / 1 ٪ حل DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج المقاطع مع دابي (0.1 ٪ في دابي PBS 1X 50ml ؛ Invitrogen القط رقم D1306) لمدة 30 دقيقة للصمة النوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل على الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة باستخدام المجهر مبائر. </li></ol> 3. يعيش التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate العيش والأجنة حقن 30 دقيقة قبل ان تصل الى مرحلة تنموية المرجوة. وضع الأجنة في حل المهدئة (0.01 ٪ Tricaine متوسطة في جنين) لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة من agarose 1 ٪ على طبق زجاج 35mm الثقافة القاع (ماتيك ؛ الجزء رقم P35G - O - 20 - C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لترسيخ agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب الحرارة الشعرية أكثر من اللهب لجعل 3 ثقوب في agarose (يمكن استخدام كائنات أخرى مثل micropipette نصائح لجعل الثقوب). ضمان عدم وجود agarose المتبقية في قعر حفرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء طبق بيتري مع متوسطة الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة الزجاج لوضع الجنين في حفرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، توجيه باستخدام ملقط الجنين الغرامة بحيث المنطقة المراد تصويره (رئيس الظهرية) في اتصال مع الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النقل بعناية طبق بيتري إلى مرحلة المجهر (وضع غطاء على طبق بيتري لمنع التبخر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما التصوير ، وضمان أن الأجنة في 28.5 درجة مئوية. </li></ol> 4. النتائج نحن هنا وصف نهج مباشرة لصورة واحدة في خلايا الأنبوب العصبي الزرد باستخدام التعبير الفسيفساء. على الرغم من الشفافية البصرية الجنين الزرد ، وجدنا أن يتعزز كثيرا من التصور الخلايا العصبية في الأجزاء التي تم الحصول عليها عبر استخدام vibratome. هذه المقاطع هي سميكة (50 ملم) مما يتيح للتصوير التمديد الخلوية من خلية معينة في طائرات التنسيق المختلفة باستخدام المجهر مبائر. وقد نشرت نتائج استخدام هذه المنهجية في أماكن أخرى 2 ، ولكن الصور ممثل الخلايا في الأنبوب العصبي للجنين WT (الشكل 1) وN - كادهيرين (N - CAD) وتقدم متحولة (الشكل 2). ويظهر الاخير ان الخلايا في المناطق الجانبية من لوحة العصبية في N - نذل المسوخ تفشل في توجيه سليم نحو خط الوسط (الشكل 2). على النقيض من هذا الوسم الفسيفساء ، والظهارة العصبية immunostaining مع علامة سطح الخلية عامة مثل بيتا catenin لا يسمح مورفولوجيا الخلايا الفردية أن تصور (الشكل 3). وقت التصوير انقضاء الأجنة الحية تكمل فسيفساء من العلامات الثابتة العينات ، مما يمكن من فهم أفضل للديناميات الخلوية التي تحدث أثناء neurulation. وكشف الفيلم أن الخلايا 1 WT بنشاط من أجل ترحيل خط الوسط من خلال توسيع نتوءات غشاء إعلامي المنحى. <img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> التعبير mGFP الرقم 1. في الأنبوب العصبي للجنين الزرد WT. <img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> التعبير mGFP الرقم 2. في الأنبوب العصبي للجنين الزرد N - كادهيرين. <img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig3.jpg" alt="الشكل 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 3"> الشكل 3. تلطيخ المناعية B - catenin من الظهارة العصبية.

<ol><li>Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish Practical approach series. , Oxford University press. (2002).</li>
<li>Hong, E., Brewster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-cadherin+is+required+for+the+polarized+cell+behaviors+that+drive+neurulation+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish.</a> Development. 133, 3895-3905 (2006).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Cell+Motility+and+Actin+Cytoskeleton+of+Individual+Neurons+and+Neural+Crest+Cells+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في الختام ، وصفت تقنيات الوسم هنا يسمح للتحليل خلية واحدة من عمليات التخلق في الجنين الزرد. التركيز الأساسي لهذا البروتوكول هو على أساليب التصوير للخلايا المسمى في الأنبوب العصبي باستخدام mGFP تحت سيطرة أحد المروجين في كل مكان. وينبغي للتطبيقات إضافية من هذا التعبير القراء مقايسة عابرة الرجوع إلى وثيقة صدرت مؤخرا من قبل اندرسون وآخرون. 3.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1976">Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain</a>. There was an error in the authors affiliations. The authors have been corrected to:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster1 1Department of Biological Sciences, University of Maryland, Baltimore County 2Center for Neuroscience, Children's National Medical Center
instead of:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster2 1Center for Neuroscience, Children's National Medical Center 2Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County

A correction to the author affiliations has been made for the article Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain.

Erratum: Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

الحلول <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هانك الاسهم # 1 : 8.0 جرام كلوريد الصوديوم ، 0.4 غرام في 100 مل بوكل د O 2 H </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هانك الاسهم # 2 : 0.358 ز نا 2 هبو اللامائى 4 ، 0،60 ز KH 2 PO 4 في 100 مل O 2 DDH </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هانك الاسهم # 4 : 0،72 ز CaCl 2 في 50 مل O 2 DDH </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هانك الاسهم # 5 : 1،23 ز MgSO 4 x7H 2 O في 50 مل د O 2 H </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 العازلة الفوسفات X : 0.8 ٪ كلوريد الصوديوم ، بوكل 0.02 ٪ ، 0.02 M PO4 ، ودرجة الحموضة 7.3 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حجب الحل : 2 ٪ مصل الماعز العادية ، الأبقار مصل الزلال 1 ٪ (BSA) ، dimethysulfoxide 1 ٪ (DMSO) </li></ul>

التوسيم وخلايا الدماغ المؤخر التصوير في اسماك الزرد

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

المفتاح لفهم العمليات التي تشكل تخلقية الجنين في وقت مبكر الفقاريات هي القدرة على الخلايا في صورة عالية الدقة. في الأجنة الزرد ، وحقن من نتائج فحص الحمض النووي البلازميد الفسيفساء في التعبير ، والسماح لتصور واحد من الخلايا أو مجموعات صغيرة من الخلايا<sup&gt; 1</sup&gt;. نحن تصف كيف يمكن استخدام حقن الحمض النووي بلازميد ترميز غشاء استهداف بروتين الفلورية الخضراء (mGFP) الخاضعة لسيطرة أحد المروجين للخلايا في كل مكان التصوير تمر neurulation. مركزية لهذا البروتوكول هي المنهجية للخلايا المسمى التصوير بدقة عالية في الفرعين ، وكذلك في الوقت الحقيقي. هذا البروتوكول ينطوي على حقن الحمض النووي في mGFP الأجنة الزرد الشباب. ثم تتم معالجة الأجنة لsectioning vibratome ، ووضع العلامات الأضداد والتصوير مع المجهر مبائر. بدلا من ذلك ، يمكن تصوير الأجنة الحية mGFP معربا عن استخدام الوقت الفاصل بين المجهري متحد البؤر. لقد اعتدنا في السابق مباشرة لهذا النهج تحليل السلوكيات التي تدفع الخلايا العصبية تشكيل الأنبوب في منطقة الدماغ المؤخر الأجنة الزرد<sup&gt; 2</sup&gt;. الاستعدادات الثابتة يسمح لرؤية غير مسبوقة من الأشكال وتنظيم الخلايا في الأنبوب العصبي في حين يعيش التصوير استكمال هذا النهج تمكن من فهم أفضل للديناميات الخلوية التي تحدث أثناء neurulation.

المفتاح لفهم العمليات التي تشكل تخلقية الجنين في وقت مبكر هو القدرة على الخلايا في صورة عالية الدقة. نحن هنا وصف تقنية لوضع العلامات خلايا مفردة أو مجموعات صغيرة من الخلايا في الأجنة الزرد كله مع غشاء استهداف بروتين الفلورية الخضراء.

إن المفتاح لفهم العمليات المورفوجينية التي تشكل الجنين المبكر للفقاريات يكمن في القدرة على تصوير الخلايا بدقة عالية. وفي سمك الزيبرا...

الهدف العام من التجربة التالية هو تصوير الخلايا العصبية بدقة عالية في جنين سمكة الزيبرا. أولاً، يتم حقن الحمض النووي DNA الذي يشفر البروتين الفلوري الأخضر المستهدف للغشاء في جنين سمكة الزيبرا في مرحلة الخلية الواحدة، مما يؤدي إلى وراثة فسيفسائية، وهو ما يسمح بتحسين تصوير الخلايا المشتتة. بعد ذلك، يتم وسم الأجنة مناعياً باستخدام anti GFP وتقطيعها إلى شرائح، مما يتيح تصور مورفولوجيا الخلايا المفردة بدقة عالية في تحضير مثبت. وبدلاً من ذلك، يمكن فحص الأجنة الحية باستخدام مجهر الفيديو التصويري المتقطع (time-lapse video microscopy) لتصوير الديناميكيات الخلوية.تُستخلص النتائج التي توضح مورفولوجيا الخلايا أو ديناميكيتها. هنا، يتم تصوير الدماغ الخلفي لسمكة الزيبرا باستخدام المجهر البؤري. مرحباً بالجميع.أنا بي آر تشاندران من مختبر الدكتورة راشيل بروستر في قسم العلوم البيولوجية بجامعة ميريلاند بالتمور كاونتي. سنعرض لكم اليوم إجراءً لوسم وتصوير الخلايا العصبية في جنين سمكة الزيبرا بدقة عالية. عادةً ما نستخدم هذا الإجراء في المختبر لدراسة آليات التجدد العصبي في جنين سمكة الزيبرا على المستوى الخلوي.لنبدأ الآن. ضع مناديل Kim wipes مبللة حول حافة طبق بتري بقطر 100 مليمتر.ثبّت إبرة حقن مجهرية زجاجية بعناية على شريط من الشمع داخل الطبق المرطب. وباستخدام مجهر تشريحي ستيريوسكوبي، قم بمحاذاة الإبرة مقابل شريحة مدرجة. وللحصول على طرف بالحجم المناسب، استخدم شفرة حلاقة نظيفة للنقر برفق على الإبرة عند النقطة التي يبلغ قطرها 1 µm.قم بتوصيل الإبرة بـجهاز الحقن المجهري، وضع 0.5 µL من محلول الفينول الأحمر والماء على غشاء البارافيلم، ثم املأ الإبرة من القطرات. اضبط ضغط الحقن المجهري على 7 kPa وابدأ بنبضة مدتها 20 ms. قم بعدد النبضات اللازمة لتفريغ كل السائل. قم بتغيير الوقت بين 10 و30 ms بحيث يستغرق التفريغ 250 نبضة تقريبًا.0.5 µL من المحلول. استخدم ماصة دقيقة لملء الإبرة عكسياً من 0.5 إلى 1 µL من MG FPD NA في الماء، مخلوطاً بـ phenol red للتصور. قم بتغطية الطبق المرطب لمنع تبخر المحلول من الإبرة تحت المجهر المجسم.ضع أجنة الأسماك في مرحلة الخلية الواحدة بشكل منفصل في طبق بتري بقطر 60 مليمتر مملوء بـ embryo.Medium. استخدم ملقطاً دقيقاً للإمساك بالغشاء الكوريوني برفق وتثبيت الجنين. حرك الإبرة المملوءة بـ MGFP و phenol red إلى المنطقة المستهدفة للحقن.للتعبير الواسع عن MGFP، يتم الحقن في المح، أو في السيتوبلازم. استخدم جهاز الحقن المجهري لحقن حوالي 2 nanoliters من محلول MGFP. راقب موقع مؤشر الفينول الأحمر للتأكد من إتمام عملية الحقن بشكل صحيح.أخرج الإبرة بعناية من الجنين. قم بحقن جميع الأجنة في الطبق، بما يصل إلى 30 جنيناً في المرة الواحدة. تجنب تعريض الأجنة للضوء، واحفظها في الحاضنة عند درجة حرارة 28.5 °C للسماح للأجنة بالنمو حتى المرحلة المطلوبة تحت المجهر المجسم.استخدم ملقطاً دقيقاً لإزالة غلاف الكوريان بلطف عن الأجنة. واستخدم ماصة باستا لإزالة غلاف الكوريان الفارغ من الطبق، مع الإبقاء فقط على الأجنة المغلفة بـ dec. استخدم ماصة باستا مصقولة بالنار لنقل الأجنة المغلفة المحقونة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter.قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط الزائد، ثم أضف واحد milliliter من ative. اغسل الأجنة في محلول 1X PBS بدرجة حرارة الغرفة 3 مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة. انقل الأجنة إلى طبق بتري مملوء بمحلول 1X PBS تحت المجهر الستيريو.استخدم ملقطًا دقيقًا للإمساك بالجنين بالقرب من منطقة الذيل. استخدم مجموعة ثانية من الملاقط أو أداة تحريك لمحاولة إزالة أكبر قدر ممكن من الـ yo دون لمس منطقة الإطار الخلفي. أثناء النظر عبر المجهر المجسم، استخدم الملقط الدقيق لرفع الجنين من الطبق ووضعه في قالب تقطيع مملوء بـ 4%low melting point.Aros.ضع الجنين باتجاه أحد طرفي القالب. اترك مادة aros تتصلب في درجة حرارة الغرفة. استخدم ملعقة مسطحة لإزالة كتلة aros المتصلبة من القالب، وبواسطة شفرة مرفوعة، اقطع الطرف السفلي للكتلة بشكل مستوٍ.استخدم قطرة من الغراء الفائق لتثبيت الكتلة على منصة الاهتزاز بحيث يكون الجانب المقطوع لأسفل إذا رغبت في ذلك. قم بمحاذاة عدة كتل على المنصة، ثم قم بتثبيت المنصة في جهاز الاهتزاز.تأكد من أن الشفرة ستقطع كل جنين بالكامل، ولكن دون أن تخترق الكتلة كلياً. املأ المنصة بقسم واحد من XPBS. اقطع الأجنة بعناية إلى خلفية كتلة واحدة وانقلها إلى طبق بتري مملوء بـ XPBS واحد.افصل المقاطع تحت المجهر الستيريو. استخدم ملقطاً دقيقاً لوضع المقاطع المطلوبة في طبق متعدد الفجوات مملوء بـ 1x PBS. استخدم فجوة مختلفة لكل جنين.صَبغ المقاطع باستخدام DPI والوسم المناعي باستخدام anti GFP. وإلا، يتم التصوير خلال 48 ساعة. ثبّت ما يصل إلى ستة مقاطع في كل شريحة وضع غطاءً زجاجياً فوق المقاطع من أجل التصوير المجهري البؤري.تُحفظ الشرائح في الظلام لتجنب التبييض الضوئي. وفيما يخص التصوير الحي، يجب حماية الأجنة المحقونة بـ MGFP من الضوء. استخدم الملاقط لجمع الأجنة قبل 30 دقيقة من وصولها إلى المرحلة التطورية المطلوبة.انقل الأجنة المغلفة إلى محلول مهدئ من وسط الأجنة يحتوي على 0.01%Trica واحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. باستخدام الماصة، ضع قطرة من 1%regular arose في الماء على طبق زراعة زجاجي القاع بقطر 35 مليمتر بحيث يملأ القالب. اترك الـ agros ليتصلب.استخدم أنبوب شعري زجاجي بطول 90 مليمتر لعمل ثلاث ثقوب في قطرة aros تحت المجهر الستيريو. افحص قاع البئر وأزل أي بقايا من aros باستخدام الملاقط. املأ الطبق بوسط الأجنة تحت المجهر الستيريو.استخدم ماصة باستور لنقل جنين واحد إلى كل ثقب في الأروس. استخدم ملقطاً دقيقاً لتوجيه الجنين بحيث تكون المنطقة المراد فحصها، وفي هذه الحالة الرأس الظهري، مستندة إلى الزجاج. غطِّ الطبق.انقل الطبق بعناية إلى منصة مجهر كونفوكالي. استخدم سخانات المساحة للحفاظ على الأجنة عند درجة حرارة 28.5 درجة مئوية طوال فترة التصوير. يظهر هنا مقطع عرضي عبر الدماغ الخلفي لجنين من النوع البري في مرحلة أربعة إلى خمسة جسيدات، مصبغ بصبغتين: GFP المستهدف للغشاء باللون الأخضر وD باللون الأزرق؛ حيث تم وسم خلية واحدة فقط بـ GFP المرتبط بالغشاء، مما يسمح بتصوير عالي الدقة للشكل المورفولوجي والتنظيم الخلوي.هذه صورة مقارنة للدماغ الخلفي لطفرة nardi في مرحلة من أربع إلى خمس قطع جسدية. وتكشف هذه الصورة أن الخلايا في طفرات nardi تفشل في التوجه بشكل صحيح نحو الخط المتوسط أثناء التطور العصبي. وعلى عكس طريقة وسم الخلايا باستخدام MGFP، فإن وسم الدماغ الخلفي بعلامة عامة لسطح الخلية مثل beta-catenin لا يسمح بتصور مورفولوجيا الخلايا الفردية.يكشف التصوير المسرّع للزمن للدماغ الخلفي لجنين مُوسوم بـ MG FP أن السلوكيات الخلوية التي تحرك التشكل العصبي في سمك الزيبرا ديناميكية للغاية وتتضمن تمدد النتوءات الغشائية أثناء هجرة الخلايا وتداخلها. لقد أوضحنا لكم للتو كيفية تحضير أجنة سمك الزيبرا، سواء المثبتة منها أو الحية، للتصوير أحادي الخلية بدقة عالية. وهذا كل شيء.شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.

labeling-and-imaging-cells-in-the-zebrafish-hindbrain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة يمكن من خلالها تحليل الدماغ النامي في أجنة الفقاريات الزرد يعيش في قرار خلية واحدة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ويشمل هذا الأسلوب الذي كنا حقن الجنين الزرد وحيدة الخلية وجبل لاحقا وصورة الدماغ النامي.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

يصف هذا البروتوكول التصوير من الخلايا العصبية الفردية أو الخلايا العصبية في قمة العيش الأجنة الزرد. ويستخدم هذا الأسلوب لدراسة سلوكيات الخلوية والتوطين أكتين باستخدام مضان مبائر الوقت الفاصل بين المجهري.

يعيش التصوير في القدرة على الحركة والهيكل الخلوي أكتين خلية من الخلايا العصبية الفردية والخلايا العصبية في الأجنة كريست اسماك الزرد

تثبيت العينة كاملة في الموضع استُخدم التهجين الموضعي في الموقف الكامل (WISH) في مقرر أحياء الفقاريات المقارنة لطلاب المرحلة الجامعية المتقدمة، بالإضافة إلى عمليات تشريح الفقاريات. وقد أتاح ذلك للطلاب فرصة دراسة أنماط التعبير الجيني إلى جانب التشريح العياني، مما ربط بين دراسة البيولوجيا الجزيئية وبيولوجيا الكائنات الحية ضمن مقرر دراسي واحد.

جبل به الجامعة في الموقع تهجين ارتباط البيولوجيا الجزيئية والعضوي

يوضح هذا الفيديو طريقة تستفيد من الجمع بين التثقيب الكهربائي والمجهر البؤري لإجراء تصوير حي لخلايا عصبية سلفية فردية في الدماغ الأمامي لسمكة الزيبرا النامية. ويمكن من خلال هذه الطريقة إجراء تحليل In vivo لتطور الخلايا العصبية السلفية في الدماغ الأمامي على مستوى استنساخي.

الوقت الفاصل بين التصوير حية من خلايا ذات صلة Clonally السلف العصبية في الدماغ المقدم اسماك الزرد النامية

يصف هذا الفيديو تقنية التشريح الدقيق للدماغ من سمكة الزرد البالغة. تساعد هذه الطريقة في الحصول على غلاف داخلي مشتق من الدماغ بالكامل يمكن دراسته بشكل أكبر.

تشريح دماغ أسماك الزرد: تقنية علم الأعصاب للأسماك

يوصف التصوير التنمية الدماغية في الزرد اليرقات. كما يتم توفير التقنيات اللازمة لتسهيل 3D التصوير وتعديل وضع الدماغية باستخدام العلاجات الكيميائية.

التصوير والإعمار 3D من الهياكل الدماغية في الجنينية اسماك الزرد

يمكن أن يلقي تصوير السلوك الديناميكي للعضيات والهياكل الخلوية الأخرى في الجسم الحي الضوء على وظيفتها في الظروف الفسيولوجية والمرضية. هنا ، نقدم طرقا لوضع علامات وراثية على عضيتين ، الجسيمات المركزية والميتوكوندريا ، وتصوير ديناميكياتها في أجنة الزرد الحية باستخدام الفحص المجهري واسع المجال ومتحد البؤر.

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

في التصوير الحي هو أداة قوية يمكن استخدامها للتحقيق في الآليات الخلوية الكامنة وراء تطوير الجهاز العصبي. هنا نحن نصف تقنية لاستخدام الوقت الفاصل الكونستوب المجهري لتصور أعداد كبيرة من الخلايا متعددة الألوان بقوس قزح المسمى في الوقت الحقيقي داخل الجهاز العصبي حمار وحشي النامية.

تصور الدماغ النامية في سمك الحمار الوحشي المعيشة باستخدام Brainbow والوقت الفاصل Confocal التصوير

هنا نقدم طريقة لتصوير الدماغ الجنيني حمار وحشي في الجسم الحي حتى اليرقات ومراحل الأحداث. هذا الإجراء المجهري، مقتبس من النهج الكهربية، ويوفر الوصول إلى التفاصيل الخلوية ودون الخلوية من الخلايا العصبية الناضجة ويمكن الجمع بينها وبين علم الوراثة البصرية والدراسات الدوائية العصبية لتوصيف وظائف الدماغ والتدخل المخدرات.

في التصوير الحي لأنسجة الدماغ النشطة بالكامل في يرقات حمار وحشي مستيقظا والأحداث عن طريق إزالة الجمجمة والجلد

يظهر هنا بروتوكول لتصوير الدماغ بالكامل في الجسم الحي ليرقات الزرد باستخدام المجهر الفلوري ثلاثي الأبعاد. يتضمن الإجراء التجريبي إعداد العينات والحصول على الصور والتصور.

في الجسم الحي تصوير الدماغ بالكامل ليرقات الزرد باستخدام المجهر الفلوري ثلاثي الأبعاد

نوضح طريقة تستفيد من الفحص المجهري متحد البؤر للمسح السريع لإجراء تصوير مباشر لخلايا الخلايا الدبقية الصغيرة في القفص البصري لسمك الزرد النامي ، مما يسمح بتحليل ديناميكيات هذه الخلايا في الجسم الحي.

التصوير الحي وتوصيف ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة في جنين الزرد

اكتشف تقنية تصوير عالي الدقة لخلايا الدماغ في أجنة أسماك الزرد باستخدام البروتين الفلوري المستهدف للغشاء. تتيح هذه الطريقة مراقبة ديناميكيات الخلايا الفردية ودراسة عمليات التشكل الحيوي أثناء التطور الجنيني.

التوسيم وخلايا الدماغ المؤخر التصوير في اسماك الزرد

استكشف المزيد من الفيديوهات