التوسيم وخلايا الدماغ المؤخر التصوير في اسماك الزرد
July 25th, 2010
المفتاح لفهم العمليات التي تشكل تخلقية الجنين في وقت مبكر هو القدرة على الخلايا في صورة عالية الدقة. نحن هنا وصف تقنية لوضع العلامات خلايا مفردة أو مجموعات صغيرة من الخلايا في الأجنة الزرد كله مع غشاء استهداف بروتين الفلورية الخضراء.
الهدف العام من التجربة التالية هو تصوير الخلايا العصبية بدقة عالية في جنين أسماك الحمار الوحشي أولا ، يتم حقن بروتين الفلورسنت الأخضر المستهدف بغشاء ترميز الحمض النووي في جنين أسماك الحمار الوحشي في مرحلة خلية واحدة ، مما يؤدي إلى وراثة الفسيفساء ، مما يتيح التصوير المحسن للخلايا المتناثرة. ثم يتم تصنيف الأجنة مناعية بمضاد GFP وتقسيمها مما يتيح تصور مورفولوجيا الخلايا المفردة بدقة عالية في مستحضر ثابت. بدلا من ذلك ، يمكن فحص الأجنة الحية باستخدام الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني من أجل تصوير الديناميكيات الخلوية.
يتم الحصول على نتائج تظهر مورفولوجيا الخلية أو ديناميكياتها. هنا ، يتم تصوير الدماغ الخلفي لسمك الزرد باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. مرحبا بالجميع.
أنا PR Chandran من مختبر الدكتورة راشيل بروستر في قسم العلوم البيولوجية بجامعة ماريلاند مقاطعة بالتيمور. سنعرض لك اليوم إجراء لتسمية الخلايا العصبية وتصويرها في جنين الزرد بدقة أعلى. عادة ما نستخدم هذا الإجراء في المختبر لدراسة آليات العلاقة العصبية في جنين أسماك الحمار الوحشي على المستوى الخلوي.
لذلك دعونا نبدأ. مكان مبلل. يمسح كيم حول حافة طبق بتري 100 ملم.
قم بتأمين إبرة الحقن المجهري الزجاجية بعناية على شريط من الشمع داخل الطبق المرطب. تحت مجهر استريو تشريح ، قم بمحاذاة الإبرة مع شريحة متدرجة. للحصول على طرف بالحجم المناسب ، استخدم شفرة حلاقة نظيفة للنقر برفق على الإبرة حيث يبلغ قطرها ميكرومتر واحد.
قم بتوصيل الإبرة بماصة جهاز الحقن المجهري 0.5 ميكرولتر من محلول الفينول الأحمر والماء على فيلم بارا وملء الإبرة الأمامية من القطرات. اضبط ضغط الحقن المجهري على سبعة كيلو باسكال وابدأ بنبضة 20 مللي ثانية احسب عدد النبضات اللازمة لتوزيع كل السائل. قم بتغيير الوقت بين 10 و 30 مللي ثانية بحيث يستغرق الاستغناء عنه حوالي 250 نبضة.
0.5 ميكرولتر من المحلول. استخدم ماصة دقيقة لردم الإبرة ب 0.5 إلى ميكرولتر واحد من MG FPD NA في الماء، ممزوجا بأحمر الفينول للتصور. قم بتغطية الطبق المرطب لمنع تبخر المحلول من الإبرة تحت المجهر الاستريو.
ضع أجنة أسماك منفصلة في مرحلة خلية واحدة في طبق بتري 60 ملم مليء بالجنين. متوسط. استخدم ملقطا دقيقا لإمساك الكوريان برفق وتثبيت الجنين. حرك الإبرة المملوءة ب MGFP والفينول الأحمر إلى منطقة الأهداف للحقن.
لتعبير MGFP واسع النطاق ، قم بحقن صفار البيض أو السيتوبلازم. استخدم جهاز الحقن المجهري لتوصيل ما يقرب من نانولتر من محلول MGFP. راقب موقع مؤشر الفينول الأحمر لتأكيد الحقن المناسب.
قم بإزالة الإبرة بعناية من الجنين. حقن جميع الأجنة في الطبق حتى 30 جنينا في وقت واحد. تجنب تعريض الأجنة للضوء والحضانة عند 28.5 درجة مئوية للسماح للأجنة بالتطور إلى المرحلة المرغوبة تحت المجهر الاستريو.
استخدم ملقطا دقيقا لتقشير الكوريان برفق من الأجنة. استخدم ماصة المعكرونة لإزالة الكتيريان الفارغ من الطبق ، مع ترك الأجنة المغلفة فقط بالديك. استخدم ماصة المعكرونة المصقولة بالنار لنقل الأجنة المطلية المحقونة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.
قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط الإضافي ، ثم أضف ملليلتر واحد من الأصيل. اغسل الأجنة في درجة حرارة الغرفة مرة واحدة XPB S3 لمدة خمس دقائق لكل منهما. انقل الأجنة إلى طبق بتري مملوء بجهاز XPBS واحد تحت المجهر الاستريو.
استخدم ملقطا دقيقا لتثبيت الجنين بالقرب من منطقة الذيل. استخدم مجموعة ثانية من الملقط أو لعبة البوكر لمحاولة إزالة أكبر قدر ممكن من اليوي دون لمس منطقة الإطار الخلفي. بالنظر تحت المجهر الاستريو ، استخدم الملقط الدقيق لرفع الجنين من الطبق إلى قالب تقطيع مملوء بنقطة انصهار منخفضة بنسبة 4٪. أروس.
ضع الجنين باتجاه أحد طرفي القالب. اسمح للأروس بالتصلب في درجة حرارة الغرفة. استخدم ملعقة لإزالة كتلة الأروس المتصلبة من القالب مع رفع الشفرة لقطع الطرف السفلي من الكتلة بالتساوي.
استخدم قطرة من الغراء الفائق لتثبيت الكتلة على مرحلة الاهتزاز ، والجانب المقطوع لأسفل إذا رغبت في ذلك. قم بمحاذاة كتل متعددة على المسرح. نعلق المرحلة على الاهتزاز.
تأكد من أن الشفرة ستقطع على طول كل جنين ، ولكن ليس بالكامل من خلال الكتلة. املأ المسرح بقسم XPBS واحد. تقطع الأجنة بعناية إلى الجزء الخلفي من كتلة أرو واحدة وتنقلها إلى طبق بتري مملوء ب XPBS واحد.
افصل الأقسام الموجودة تحت المجهر الاستريو. استخدم ملقطا دقيقا لوضع الأقسام المرغوبة في طبق متعدد الآبار مملوء ب XPBS واحد. استخدم بئر مختلف لكل جنين.
قمبتلطيخ الأقسام ب DPI والملصق المناعي بمضاد GFP. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بالتصوير في غضون 48 ساعة. قم بتركيب ما يصل إلى ستة أقسام لكل شريحة وضع زلة غطاء أعلى الأقسام للتصوير متحد البؤر.
قم بتخزين الشرائح في الظلام لتجنب تبييض الصور. التصوير الحي ، يجب حماية الأجنة المحقونة MGFP من الضوء. استخدم الملقط لطلاء الأجنة قبل 30 دقيقة من وصولها إلى مرحلة النمو المرغوبة.
انقل الأجنة المطلية إلى محلول مهدئ من وسط الجنين مع 0.01٪ Trica تحتضن درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. نشأت قطرة ماصة 1٪ عادية في الماء على طبق استزراع زجاجي مقاس 35 ملم بحيث يملأ القالب. اسمح للزراعة بالتصلب.
استخدم الأنبوب الشعري الزجاجي مقاس 90 ملم لعمل ثلاثة ثقوب في قطرة الأروس تحت المجهر الاستريو. افحص قاع البئر وقم بإزالة أي بقايا من الشقوق بالملقط. املأ الطبق بوسط الجنين تحت المجهر الاستريو.
استخدم ماصة المعكرونة لنقل جنين واحد إلى كل ثقب في الحضيرة. استخدم ملقطا دقيقا لتوجيه الجنين بحيث تكون منطقة الاهتمام في هذه الحالة الرأس الظهري على الزجاج. غطي الطبق.
انقل الطبق بعناية إلى مرحلة المجهر متحد البؤر. استخدم سخانات الفضاء للحفاظ على الأجنة عند 28.5 درجة مئوية طوال التصوير. فيما يلي قسم من خلال الدماغ الخلفي لجنين من النوع البري في أربعة إلى خمسة جسيدات مزدوجة مسمى بغشاء مستهدف GFP باللون الأخضر و D باللون الأزرق ، يتم تصنيف خلية واحدة فقط ب GFP مرتبط بالغشاء مما يسمح بتصوير عالي الدقة للمورفولوجيا الخلوية وتنظيمها.
هذه صورة مماثلة للدماغ الخلفي لمتحور ناردي دين في ما يصل إلى خمسة جسيدات. تكشف هذه الصورة أن الخلايا الموجودة في ناردي والطفرات تفشل في التوجيه بشكل صحيح نحو خط الوسط أثناء الكشف العصبي. على عكس طريقة تمييز الخلايا باستخدام علامة MGFP للدماغ الخلفي باستخدام علامة سطح الخلية العامة مثل بيتا كاتينين لا تسمح بتصور مورفولوجيا الخلايا الفردية.
يكشف التصوير بفاصل زمني للدماغ الخلفي للجنين المسمى MG FP أن سلوكيات الخلية التي تدفع العلاقة العصبية في أسماك الحمار الوحشي ديناميكية للغاية وتتضمن امتداد نتوءات الغشاء حيث تهاجر الخلايا وتتجمع بينها. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تحضير أجنة أسماك الحمار الوحشي الثابتة والحية للتصوير أحادي الخلية بدقة عالية. هذا كل شيء.
شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تقدم هذه الدراسة تقنية لتصوير عالي الدقة للخلايا العصبية في أجنة الأسماك الزرد باستخدام بروتين فلوريسنت أخضر موجه للمغلف. تتيح الطريقة تصور الخلايا الفردية وديناميكياتها، مما يوفر رؤى حول العمليات المورفولوجية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- تقنيات التصوير
الخلفية
- فهم التطور الجنيني أمر بالغ الأهمية لعلم الأحياء النمائي.
- تقنيات التصوير عالية الدقة ضرورية لدراسة شكل الخلايا.
- تعتبر الأسماك الزرد كائنًا نموذجيًا بسبب أجنتها الشفافة.
- تعزز البروتينات الفلوريسنتة الموجهة للمغلف قدرات التصوير.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة لتمييز الخلايا العصبية وتصويرها في أجنة الأسماك الزرد.
- تمكين تصور شكل الخلية وديناميكياتها بدقة عالية.
- تسهيل دراسة العمليات المورفولوجية خلال التطور المبكر.
الطرق المستخدمة
- حقن الحمض النووي المشفر للبروتين الفلوريسنت الأخضر الموجه للمغلف في أجنة بمرحلة الخلية الواحدة.
- يسمح الميراث الفسيفسائي بتصوير محسن للخلايا المتناثرة.
- التصنيف المناعي بمضاد GFP للتحضيرات الثابتة.
- التصوير الحي باستخدام ميكروسكوب الفيديو التسلسلي الزمني لمراقبة ديناميكيات الخلايا.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح لشكل الخلية الفردية في أجنة الأسماك الزرد.
- تصوير ديناميكي للخلايا العصبية في الأجنة الحية.
- استخدمت الميكروسكوبية المجسمة لتصوير الدماغ الخلفي للأسماك الزرد.
- تظهر النتائج فعالية تقنية التصوير.
الاستنتاجات
- توفر التقنية أداة قوية لدراسة التطور الجنيني.
- يمكن للتصوير عالي الدقة الكشف عن رؤى حول ديناميكيات الخلايا.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة في دراسات مختلفة في علم الأحياء النمائي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
High-resolution cellular imaging in zebrafish embryos enables precise visualization of neural cell morphology and dynamic behaviors during early development. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in neurodevelopmental research pipelines. The approach enhances predictive confidence for early-stage discovery and translational studies involving vertebrate neural systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neural morphogenesis at single-cell resolution for pathway clarification.
- Supports biological de-risking by visualizing cell orientation and migration during neurulation.
- Facilitates functional target validation through direct observation of cellular behaviors in vivo.
Screening & Assay Development
- Prepares validated zebrafish models for downstream imaging-based assays.
- Standardizes cell labeling and imaging protocols for reproducible quantitative outputs.
- Enables scalable screening of genetic or pharmacological perturbations affecting neural development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling vertebrate neural tube formation.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation through live and fixed imaging outputs.
- Supports risk-adjusted advancement by revealing cellular mechanisms underlying developmental phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging methodology integrates into the early discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing and mechanistic studies in vertebrate neural development.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven analysis of neural cell behaviors and morphogenetic processes.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for comparative studies.
- Analytics: Delivers high-content morphological and dynamic readouts for condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models of neural development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse neurodevelopmental investigations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing direct evidence of cellular phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling and microinjection techniques.
- Needs access to confocal microscopy and immunolabeling infrastructure.
- Demands cross-team standardization of imaging and labeling protocols.
- Adaptation may be needed for different developmental stages or genetic backgrounds.
- Photo-bleaching and mosaic expression are practical limitations to consider.
