فلاش التجميد وCryosectioning E12.5 مخ الفأر

مرحباً، أنا سبنسر كيرلي من جامعة كاليفورنيا إيرفاين ومختبر إيد ماكي، وسأقوم بتوضيح كيفية إجراء التقطيع بالتجميد. وللقيام بذلك، سأستخدم أولاً هذه الكواشف شائعة الاستخدام. مركب التضمين أو وسط التضمين الذي أستخدمه يسمى OCT، وهو اختصار لدرجة حرارة القطع المثلى.

إنه محلول شفاف، ويمتاز بقوام كثيف ولزج للغاية، وهو يثبت النسيج بشكل جيد بينما يمكنك توجيهه ثم يتجمد، وفي النهاية هو قابل للذوبان في الماء لذا يمكنك التخلص منه خلال أي نوع من إجراءات التصبيغ. لذا أقوم بتضمين النسيج في قالب. وتأتي حاويات خزعات قوالب التجميد هذه بأحجام متنوعة.

سأستخدم هذا القالب الأصغر هنا لأنني أعمل على أنسجة جنينية من الفأر. نقوم بتجميد أنسجتنا تجميداً سريعاً باستخدام النيتروجين السائل. لذا، سأقوم أولاً بملء هذه القارورة المفرغة الواقية بالنيتروجين السائل من الخزان الموجود هنا.

قبل التجميد السريع للأنسجة، يجب القيام بما يسمى بالحماية من التجميد (cryoprotection)، وإلا فإن عملية التجميد نفسها ستؤدي إلى تدمير الأنسجة. لذا، يتم غمر الأنسجة في محلول sucrose بتركيز 30% طوال الليل. ولا بأس إذا استغرق الأمر وقتًا أطول، طالما أن الأنسجة قد غطست في المحلول.

وكما تلاحظون، فإن رؤوس الفئران في اليوم الجنيني 12.5 قد غمرت في محلول السكروز، وبذلك أصبحت جاهزة للتجميد. سأقوم الآن ببساطة بسكب الأنسجة الموجودة في محلول السكروز في طبق أكبر لأتمكن من التعامل مع الأنسجة. سآخذ بعضاً من مركب OCT وأسكبه في هذا الطبق الذي يبلغ قطره 35 مليمتر، والذي يستند في الواقع على غطائه لأتمكن من الحصول عليه بزاوية مائلة.

لذا يتراكم الـ OCT على طول الحافة من أجل العمق. لذا سأستخدم زوجًا من الملاقط القديمة غير الحادة ببساطة لأنك لست بحاجة لأن تكون حادة ولا تريد إتلاف زوج آخر من الملاقط. لذا، آخذها وأرفع أحد هذه الرؤوس برفق شديد، وأضعه في حمام الـ OCT الأول هذا.

أريد فقط تغليف الجنين في OCT. يتيح ذلك تجميداً أفضل وأكثر تجانساً للأنسجة. يجب التأكد من عدم وجود أي بقايا من السكروز حول النسيج أو أي فقاعات هوائية.

تجنب تكون الفقاعات الهوائية تماماً. لذا، سأقوم بتحريك مركب OCT بلطف حول وتحت الرأس، مع تحريك الرأس داخل مركب OCT وتركه هناك لبضع ثوانٍ بينما أملأ قالب التجميد. والآن سأقوم بملء قالب التجميد بمركب OCT، مع الحرص مجدداً على تجنب الفقاعات.

سأقوم بملئه حتى أعلى القالب. وكما ستلاحظون، فقد وضعت علامة على القالب، وبذلك سأتمكن من معرفة اتجاهه بعد أن يتجمد.

عندما يتجمد مركب OCT، يتحول لونه إلى الأبيض، وعندها لن تتمكن من رؤية النسيج. لذا، يجب عليك بالتأكيد وضع علامة باستخدام قلم تحديد دائم على قالب التجميد (cryo mold).

لقد تكونت بالفعل فقاعة في وسط الـ OCT، لذا سأستخدم الملقط لدفعها خارج الحافة. لا ينبغي أن تتدخل هذه الفقاعة في عملية تجميد الأنسجة. الآن سأقوم بنقل الرأس من هذا الطبق إلى وسط الـ OCT الموجود في القالب.

سأقوم ببساطة برفع العينة من الطبق ووضعها في القالب برفق شديد. بعد ذلك، سأنتقل إلى المجهر حيث سأقوم بتوجيه النسيج. العينة الآن موجودة في قالب التجميد الخاص بي، وسأقوم بالنظر عبر المجهر حتى أتمكن من توجيهها.

سأقوم بإجراء قطاعات إكليلية عبر رأس الفأر هذا. لذا، أحتاج إلى توجيهه بحيث يمكنني وضعه في الميكروتوم بالتبريد (cryostat) لإجراء القطاعات الإكليلية. ومرة أخرى، أستخدم هذه الملاقط القديمة ذات الرؤوس الثلمة، وكما ترون، توجد بعض الفقاعات هنا وسأبذل قصارى جهدي لإخراجها.

لكن هذه الفقاعات الأصغر ليست ضارة. لم ألاحظ أي تأثير لهذه الفقاعات الصغيرة. كل ما يجب تجنبه هو الفقاعات الكبيرة.

لذا سأقوم بتحريكها للخارج قدر المستطاع، وسأقوم بالتأكيد بمسح الملقط بشكل متكرر لأن ذلك يساعد في تجنب تكون الفقاعات بشكل أفضل. والآن، إذا كنتم ترون الملصقات التي وضعتها، لدي حرف T هنا في الأعلى وحرف F على يساري. هذا يشير لي بأن الرأس، أو الجزء العلوي من الرأس، سيكون للأعلى، وأن الجهة الأمامية أو الوجه سيكون على يساري.

بهذه الطريقة أعرف أي سطح سأقوم بتقطيعه للحصول على المقاطع الإكليلية، وأنا أقوم فقط بدفع النسيج برفق. ومرة أخرى، يؤدي ذلك أحياناً إلى ظهور فقاعات، لذا ستحتاج إلى دفعها للخارج حتى لا تتجمد جنباً إلى جنب مع النسيج. فمن السيئ وجود فقاعات، ويرجع ذلك أساساً إلى أن فقاعات النسيج يمكن أن تسبب تجميداً غير متسق أثناء عملية التجميد.

الغرض من التجميد السريع هو تجميد كل شيء دفعة واحدة. كما أنه عند التقطيع عبر النسيج باستخدام جهاز الميكروتوم المبرد (cryostat)، فإنه إذا مرّت الشفرة عبر فقاعة بدلاً من مركب OCT أو النسيج، فقد يتسبب ذلك في تعثر أو تمزق، مما يؤدي إلى تدمير النسيج أو تلفه. لذا، يجب بالتأكيد تجنب هذه الفقاعات بأي ثمن.

وخاصة الأنسجة الأكبر حجماً. لذا لا أزال أقوم بتوجيهها هنا. لقد تم تثبيت هذا النسيج لمدة 24 ساعة، لذا فهو متماسك تماماً تجاه عمليات المناولة التي أجريها.

قد تكون الأنسجة الأخرى أكثر ليونة قليلاً، لذا يجب توخي الحذر الشديد. وبمجرد وضع العينة تحت المجهر بحيث يكون الوجه جهة اليسار وأعلى الرأس للأعلى، سأحتاج إلى التأكد من صحة وضعها في مستويات التوجيه الأخرى أيضاً. لذا، سأقوم برفع العينة وفحص جميع أوجه المكعب للتأكد من صحة وضعها.

وأرى أنها مائلة للأسفل قليلاً، لذا عليّ فقط رفعها باستخدام الملقط. حسناً؟ وهذا بالتأكيد يتطلب الكثير من الممارسة. حسناً، تبدو جيدة.

سأقوم الآن بالانتقال إلى هنا وتجميد العينة في النيتروجين السائل. حسناً، بعد توجيه النسيج بشكل صحيح في قالب التجميد، سأقوم بسكب النيتروجين السائل في هذا الطبق هنا. هذا مجرد طبق بتري بلاستيكي عادي لزراعة الأنسجة، سأملؤه حتى الحافة.

يتبخر السائل بسرعة كبيرة. سأستخدم الملقط لخفض قالب التجميد (cryo mold). وكما ترون، فقد قمت في الواقع بثني الحافة السفلية.

يتيح ذلك بالتأكيد تعاملاً أفضل. سأقوم بتجميده الآن، ومع تجمد النسيج ومركب OCT، يتحول اللون إلى الأبيض الصلب.

وبمجرد اكتمال العملية، سيتحول اللون بالكامل إلى الأبيض. وبعد ذلك، يجب عليّ نقل النسيج المجمد بسرعة إلى مجمد درجة حرارة -80 °C للتخزين. يجب الإمساك به بحيث لا ينغمر النسيج.

لذا، يجب توخي الحذر الشديد للإبقاء عليه عند السطح العلوي للنيتروجين السائل فقط. حسنًا، لقد تجمد الآن. أبقِه هناك لبضع ثوانٍ إضافية قبل أن أنقله إلى درجة حرارة -80.

حسناً، سأقوم الآن بنقلها إلى درجة حرارة 80- مئوية. لقد أخذتُ النسيج من درجة حرارة 80- مئوية ووضعته في هذا الميكروتوم المجمد (cryostat) هنا. درجة حرارة الغرفة في الواقع منخفضة لتصل إلى 24- درجة Celsius.

في الوقت الحالي، يجب ترك النسيج ليتوازن لمدة تتراوح بين نصف ساعة إلى ساعة تقريباً قبل البدء في عملية التقطيع؛ وإلا سيكون النسيج هشاً للغاية. وبما أن جميع أجهزة المقطاعات بالتجميد (cryostats) تختلف عن بعضها، سأوضح فقط بعض النقاط الأساسية المتعلقة بهذا الجهاز هنا.

لذلك نستخدم جهاز Leica CM 30 50 s. إنه جهاز جيد لأنه يحتوي على وحدة تبريد منفصلة للعينة نفسها، وهو ما يمثل ميزة إضافية مفيدة. حيث يمكنك ضبط درجة حرارة العينة، إذ تتطلب الأنسجة المختلفة درجات حرارة متفاوتة لعملية القطع.

لذا، عند تحميل النسيج لأول مرة، ستحتاج إلى إجراء عدة تعديلات. وهذه التعديلات متشابهة في جميع أجهزة الميكروتوم المجمد (cryostats)؛ حيث يكون بعضها إلكترونياً، بينما يتم تشغيل البعض الآخر يدوياً.

على سبيل المثال، ستحتاج إلى سحب ذراع المقطاع بالتجميد (cryostat) أو تقديمه لضبط موضعه ليكون أبعد أو أقرب من الشفرة. يمكنك القيام بذلك بسرعة أو ببطء. كما يمكنك ضبط سمك القطع باستخدام علامتي الزائد أو الناقص هنا.

وبعد ذلك، ستختار بين سماكة التشذيب (trim) أو سماكة المقطع (section thickness)، وهو ما يشير إليه الزر الأوسط هنا. يمكنك ضبط درجة حرارة الغرفة أو العينة نفسها بجوار هذه الشاشة الرقمية ببساطة عن طريق الضغط على هذا الزر واستخدام السهمين للأعلى أو للأسفل لتعديل درجة الحرارة. وبالنسبة لنا، عندما نقوم بإجراء القطع بالتجميد (cryosectioning)، فإننا نستخدم شرائح المجهر من نوع Super frost plus من العلامة التجارية Fisher.

تكون مغطاة ببعض المواد اللاصقة حتى لا ينفصل النسيج أثناء المعالجة. تلاحظ أحياناً أثناء عملية التقطيع أن النسيج يبدو ليناً بعض الشيء، ومن المؤشرات على ذلك أن يتجمع النسيج عند ملامسته للشفرة. ولإصلاح ذلك، يمكنك استخدام منتج Fisher brand super friendly freeze.

إنها تقوم بالتجميد السريع للأنسجة؛ حيث تقوم بتوجيهها نحو النسيج والضغط على الزناد، وسوف تعيد تجميد النسيج بسرعة إذا كان ليناً جداً. وقبل تثبيت النسيجة على حامل العينات (chuck) لعمل القطاعات، أود أن آخذكم في جولة سريعة لبعض المكونات الموجودة في هذه الآلة. هذا هو المكان الذي يتم فيه تحميل الشفرة فعلياً، والتي يتم تثبيتها بواسطة هذه الصفيحة المعدنية.

من خلال سحب هذا الذراع، يمكنك في الواقع إزالة الشفرة واستبدالها حسب الحاجة. تأكد من تثبيتها بشكل جيد. يجب ألا تبالغ في تثبيت الشفرة، وإلا فإنها قد تتعرض للالتواء.

وستلاحظ عند إجراء القطاعات أن سُمك النسيج ليس متسقاً. لذا، لا تضغط هذا الذراع إلى الأسفل تماماً، بل اجعله يصل إلى مستوى موازٍ للشفرة نفسها تقريباً.

هذا أمر آخر قد تضطر إلى ضبطه أثناء عملية التقطيع، ويُسمى صفيحة منع الدوران (anti-roll plate). وهي عبارة عن قطعة زجاجية توضع في هذا الحامل هنا، ويمكنك ضبطها باستخدام هذا المسمار ذو الزنبرك.

وبشكل أساسي، يمكنك تحريكه للأمام أو للخلف، وهذا سيحافظ على استواء الأنسجة أو المقاطع الخاصة بك حتى تتمكن من تثبيتها على الشريحة. ومن الأمور الأخرى التي قد ترغب في ضبطها أثناء عملية التقطيع هي الموضع الموجود على الشفرة والذي يقوم بعملية القطع الفعلية.

وإليك كيفية ضبط ذلك؛ فما عليك سوى رفع هذه الرافعة، وعندها يمكنك تحريك الجهاز بأكمله يميناً أو يساراً. ولا تستخدم هذه الميزة إلا إذا لاحظت أن النسيج يلتصق بجزء معين من الشفرة، أو إذا كنت ترغب في توفير الشفرات نظراً لارتفاع ثمنها. لذا، يمكنك العثور على منطقة نظيفة ومناسبة ببساطة عن طريق تحريك الجهاز ذهاباً وإياباً.

هناك أمر آخر يمكنك ضبطه وهو زاوية القطع. يوجد الآن على الجانب هنا، وهو جزء لن تتمكن من رؤيته، ثلاثة مواضع مختلفة. نحن نستخدم الموضع الأوسط فقط، ويمكنك ضبط ذلك عن طريق رفع هذه الرافعة الأخرى.

وبإمكانك تحريك هذه الأداة للأعلى وللأسفل، لكننا نبقيها دائماً في المنتصف، لذا سأبقيها على هذا الوضع الآن.

هذا الجزء الموجود هنا هو رأس المبرد (cryostat)، وهو الذي يحمل عينة النسيج المجمدة أثناء عملية التقطيع، حيث يتحرك للأعلى وللأسفل ويتقدم باتجاه الشفرة.

وبشكل أساسي، يتم تثبيت النسيج على هذا الرأس (chuck) هنا، ثم نضع الرأس في الرأس المخصص له، ونقوم بإحكامه، وبعد ذلك نستخدم هذه المقابض في الخلف لضبط الزاوية من أجل الحصول على قطع أكثر استقامة. والآن سأقوم بتثبيت النسيج على الرأس. يجب الحفاظ على الرؤوس في درجة حرارة الغرفة لأنك ستضيف أولاً طبقة من OCT، ولا تريدها أن تتجمد على الفور لأنك تريدها أن تكون طبقة مسطحة ومرتبة.

وسنستخدم هذه الأداة هنا، وتسمى مستخلص الحرارة. في الواقع، ستُستخدم لتسطيح قالب الـ OCT أثناء تجمده. لذا، ما سأفعله أولاً هو أخذ القالب في درجة حرارة الغرفة ووضعه في هذا الحامل هنا.

خذ بعضاً من فقاعات OCT الخاصة بي. لا يهم الأمر هنا لأنها ستُضغط للخارج. فقط أضف القليل، لست بحاجة إلى الكثير.

خذ مستخرج الحرارة وضعه هناك مباشرة. انتظر بضع ثوانٍ، وعندها يمكنك أن ترى أن OCT مسطح تماماً.

لقد حصلت الآن على النسيج وأحتاج إلى تحديد مركب OCT الفعلي. حسناً، سأحدد نقطة على مركب OCT للإشارة إلى موضعه. هكذا، لقد حددت الجزء العلوي بنقطة زرقاء.

والآن سأقوم بإخراج كتلة النسيج من القالب، وأفعل ذلك ببساطة عن طريق الضغط على الجزء الخلفي منه. لذا، سأضغط برفق على الخلف لأدفعها إلى يدي، ولكن مرة أخرى، لا أريد لها أن تذوب، لذا سأعيدها على الفور.

يمكنكم الآن رؤية كتلة النسيج التي تحمل العلامة الزرقاء التي وضعتها، وبذلك أعرف أن هذا هو الجزء العلوي من رأس الجنين. وأريد إجراء قطاعات عبر الوجه لأن هذه قطاعات إكليلية.

سأقوم الآن بإضافة قطرة أخرى كبيرة من OCT، ويجب أن أتصرف بسرعة لأن كل شيء بارد. سآخذ النسيج وأضعه في المنتصف تماماً، مع التأكد من استوائه فوق طبقة OCT التي تم تحضيرها مسبقاً. سأتركه الآن ليتجمد، وسيستغرق ذلك دقيقة أو دقيقتين تقريباً.

لقد انتهت عملية التجميد الآن. وسأقوم بأخذ النسيج المثبت على القرص، ووضعه في الرأس، مع الحرص على أن يكون مستقيماً قدر الإمكان، ثم إحكام ربطه حتى يصبح ثابتاً تماماً.

سأقوم بوضعه أمام الشفرة مباشرة ثم دفعه للأمام، وهو ما قد يستغرق عدة ثوانٍ. حسناً، سأستخدم الآن الحافة المسطحة للشفرة لإجراء ضبط دقيق لموضع النسيج. لذا سأقوم ببساطة بمراقبة الحافة وتحريك النسيج للأعلى وللأسفل للتأكد من محاذاة الحواف.

إذا لم يحدث ذلك، كما تعلمون، فقد يبدو الأمر بهذا الشكل. أنا أبالغ في التوضيح بالطبع، ولكن يمكنك أن ترى هنا أنه ليس مستقيماً تماماً مقابل الشفرة. لذا، أستمر في إجراء التعديلات حتى أشعر أنه أصبح في أكثر وضع مستقيم يمكنني الوصول إليه.

أعتقد أن هذا جيد للغاية. لذا، أقوم بالفحص من كل زاوية للتأكد من أن النسيج سيُقطع بشكل مستقيم مقابل الشفرة، وأستخدم حافة الشفرة لتحديد ذلك. أنا أنظر من الأعلى ومن الجانب، ويبدو النسيج في الواقع جيداً جداً.

لا أحتاج إلى إجراء العديد من التعديلات، ولكن إذا لزم الأمر، سأستخدم المقابض الموجودة في الجزء الخلفي من الرأس. ومن خلال تدوير هذه المقابض لليسار أو اليمين، يمكنك ملاحظة أنه يمكن إجراء تعديلات دقيقة بهذه الطريقة. ولكن يبدو الأمر جيداً جداً.

والآن، أقوم بدفع النسيج للأمام. إنه لا يُقطع بعد لأنه لم يلامس الشفرة، فالنسيج مغمور في عمق مركب OCT.

لذا قد يستغرق الوصول إلى النسيج عدة دقائق. يجب تجنب التحرك بسرعة كبيرة لأن ذلك قد يؤدي إلى تعثر الشفرة وتصدع الـ OCT والنسيج، ولكن لا ينبغي أيضاً التحرك ببطء شديد لأن العملية قد تستغرق وقتاً طويلاً جداً. تتوفر في هذه الماكينة وظيفة مفيدة تتيح لك إجراء عملية تشذيب (trim) عند مقطع أكثر سمكاً، مما يسمح لك بالتحرك بشكل أسرع.

أقوم الآن بالقطع فعلياً من خلال مركب OCT، لذا سأبطئ السرعة قليلاً. لم أصل إلى النسيج بعد، ولكن هذا هو الوقت الذي أقيم فيه كيف ستسير عملية التقطيع. فهناك العديد من المتغيرات التي يمكن أن تجعل عملية تقطيع النسيج تسير بشكل جيد جداً أو بشكل سيئ للغاية.

ما ألاحظه أنه يحدث غالباً مع هذا المبرد (cryostat) هو أن النسيج يكون في الواقع بارداً جداً. لقد قمت بخفض درجة الحرارة، ولكن يبدو أنه لا يزال بارداً بعض الشيء. وما يحدث هو أن الشفرة تهتز أثناء القطع خلال النسيج أو خلال مادة الـ OCT.

لذا ستظهر هذه الخطوط الصغيرة، هذه الخطوط الأفقية عبر الـ OCT. ما أفعله هو أنني أستخدم إبهامي لتدفئة الحافة، تدفئة الـ OCT ببساطة عن طريق لمسها برفق، وتحريك إبهامي فوقها، لفترة وجيزة فقط. وبعد ذلك، عندما أقوم بعمل القطاعات العرضية من خلالها، ألاحظ أنها تظهر بشكل أفضل بكثير وأن التقطع (chattering) قد توقف.

هذه هي الأمور التي سأقوم بتقييمها قبل البدء في التعامل مع النسيج. لقد لاحظتُ أنه بينما تمر الشفرة عبر النسيج، يحدث تعثر أو، في الواقع، تشقق في مادة الـ OCT. لذا، فإن أحد أول الأشياء التي أقوم بها هو تغيير الشفرة.

لست متأكداً من المدة التي قضتها هذه الشفرة هنا ومن استخدمها قبلي، لذا سأقوم ببساطة باستخراج شفرة جديدة. من الواضح أن هذه الشفرات حادة جداً، لذا يجب توخي الحذر. سأقوم بضبط لوحة منع الدوران، وهناك مسمار محمل بزنبرك في الأسفل هنا، عليك فقط الوصول إليه من الأسفل ويمكنك تحريكه للداخل أو الخارج.

لقد قمت بالتقدم والتقطيع لدرجة كافية للوصول الآن إلى الأنسجة. وللأسف، يوجد شق عبر كتلة الـ OCT، وهو أمر يحدث كثيراً وللأسف لا يمكنك التحكم فيه فعلياً، ولكن هناك أشياء يمكنك القيام بها لإصلاحه. أما إذا كان الشق قد مر عبر الأنسجة، فعندئذٍ يجب عليك التخلص من العينة أو محاولة إنقاذ ما يمكن إنقاذه.

في هذه الحالة، يبدو أن الشق يقع فوق النسيج. لذا، سأقوم باستخدام شفرة حلاقة كانت موجودة في جهاز المقطع المبرد (cryostat)، فهي مبردة.

سأحاول فقط قص الجزء المتشقق، الموجود في الجزء العلوي من قالب الـ OCT. لذا، سأستخدم إبهامي مجدداً لتسخين وجه قالب الـ OCT. ومن ثم سأقوم بالتقطيع، وكما ترون هنا، يوجد تشقق.

لقد قمت بإزالة القطعة التي تحتوي على النسيج، ثم تخلصت من بقية جزء الـ OCT، وهو الجزء المتشقق. لذا، سأحاول الآن قص ذلك الجزء المتشقق باستخدام شفرة حلاقة مبردة. يجب أن يكون القص مستقيمًا تمامًا، مع استخدام كلتا يدي لتوزيع الضغط بالتساوي على الشفرة.

سأقوم بتحريك الشفرة ذهاباً وإياباً داخل الـ OCT. لذا، أقوم بالتحريك ذهاباً وإياباً، مع القطع ببطء في الـ OCT، على أمل إزالة الجزء المتشقق.

حسناً، سأقوم بالقص من خلال إزالة هذا الجزء الزائد من الـ OCT. حسناً، يبدو الأمر جيداً. سأقوم بعد ذلك بسحب الرأس قليلاً لأنني أنشأت حوافاً قد تعيق حركة الشفرة، وإذا حدث ذلك، فقد يؤدي ذلك فعلياً إلى تكسر الـ OCT والأنسجة، مما سيتلف عينتي.

لقد تراجعتُ للخلف، لذا سأحتاج إلى التقدم قليلاً للأمام للعودة إلى النسيج، وآمل أن أكون قد صححتُ الشق. حسناً، أنا الآن أعود إلى النسيج. حسناً، يبدو أنني قد صححته بالفعل.

بذلك لم يعد هناك أي شقوق في الـ OCT، مما يجعل عملية التقاط المقاطع أسهل بكثير. والآن سأنتقل إلى جزء النسيج الذي يهمني. في هذه اللحظة، بدأت للتو في الوصول إلى السطح وأود الدخول إلى دماغ هذا الجنين.

تعد هذه الأجزاء كبيرة بما يكفي لأتمكن فعلياً من رؤية البنى التي تهمني. لقد أغفلت ذكر أنني أستخدم هذه الفراشي لتنظيف الشفرة بين كل مقطع أقوم بتصويره. أما هذه الفرشاة الكبيرة فهي مخصصة فقط لتنظيف المنطقة وإزالة فائض الـ OCT.

أستخدم أيضاً هذه الفرش الأدق لتحريك المقطع مقابل هذه اللوحة الباردة هنا لضبط موضعه عند التقاطه على الشريحة. ومرة أخرى، يتم الحفاظ على هذه الأدوات باردة، حتى لا يذوب الـ OCT ويلتصق بالفرش. ولالتقاط النسيج، سأقوم أولاً بتسخين الـ OCT والنسيج باستخدام إبهامي.

وسآخذ إحدى هذه الشرائح التي قمت بتسميتها مسبقاً. أمسكها مقلوبة، وكل شخص يفعل ذلك بطريقة مختلفة، لكن الطريقة التي أتبعها هي أنني أفضل الإمساك بالزاوية العلوية اليمنى بيدي اليمنى بينما تكون الشريحة متجهة للأسفل.

ثم أستخدم إبهامي الأيسر كنقطة ارتكاز حتى أتمكن من النزول مباشرة نحو الشريحة والتقاط المقطع. سينصهر الـ OCT والأنسجة فعليًا فوق الشريحة وتثبت نفسها. لذا، سأقوم أولاً بتدفئة النسيج بإبهامي، ثم أقطع المقطع ببطء، وأمسك شريحتي، وأثبت الزاوية اليمنى بيدي اليمنى، ثم أحرك الصفيحة، وأخفضها مباشرة لأسفل، وأتركها تنصهر.

سأقوم بفحص النسيج للتأكد من عدم وجود طيات أو فقاعات ومن أن مظهره جيد. وسأستمر في القيام بذلك حتى أنتهي من تقطيع الدماغ بأكمله. أقوم الآن بفحص المقاطع عبر مجهر التشريح للتأكد من سلامة مظهرها، وهي تبدو كذلك؛ حيث يمكنك رؤية الدماغ الأمامي في الجزء العلوي من المقطع، وجميعها تبدو جيدة جداً.

يمكنك استخدام هذه المقاطع المجمدة في تطبيقات مثل التهجين الموضعي (in situ hybridization). ونقوم أحياناً بإجراء فحوصات نسيجية أساسية، مثل صبغات الهيماتوكسيلين والإيوزين (h and e stains). كما يمكنك أيضاً إجراء التألق المناعي، ومجموعة من المقايسات المماثلة.

بالنسبة لي على وجه الخصوص، تم تثبيت هذه المقاطع ومعالجتها من أجل التهجين الموضعي. وهذا ما سأقوم به في الخطوة التالية.