Photoconversion منقى من البروتينات ونيون المزدوجة التحقيق تسليط الضوء البصري في الخلايا الحية

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام البروتينات الفلورية M orange two andron للتحديد الضوئي المزدوج المسبار من أجل وسم أربعة مجتمعات خلوية فردية أو مقصورات خلوية بشكل انتقائي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إضاءة الخلايا بضوء تحفيز طوله الموجي 488 nanometer وبكثافة منخفضة لإيقاف جميع الفلورية الخضراء. وفي خطوة ثانية، يتم تعريض الخلايا لضوء تحفيز طوله الموجي 488 nanometer وبكثافة عالية، مما يؤدي إلى التحويل الضوئي لفلورية m orange إلى اللون الأحمر.

بعد ذلك، تُعرَّض الخلايا لإثارة ثنائية الفوتونات بطول موجي 800 nanometer من أجل تفعيل الفلورة المزدوجة. ومرة أخرى، تم الحصول على نتائج تُظهر إمكانية وسم الخلايا في أربع تركيبات متميزة بناءً على التمييز البصري بالمجسات المزدوجة باستخدام M Orange two و drawn ppa. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذا الإجراء مقارنة بالتجارب الحالية مثل التجزيء تحت الخلوي في أنه يتم تنفيذه على خلايا حية.

يمكن لهذا الإجراء أن يساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في بيولوجيا خلايا بيتا، مثل سبب إفراز جزء صغير فقط من حويصلات الإنسولين. ورغم أن هذا الإجراء يمكن أن يوفر رؤى حول وظيفة خلايا بيتا، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضاً على أنظمة أخرى؛ على سبيل المثال، تتبع الخلايا السرطانية في الجسم الحي. تتكون عينة قطيرات البروتين الفلوري من مستحلب مائي ثماني مع وجود بروتين فلوري في الطور المائي.

يتم وضع هذا المستحلب بين شريحة مجهرية وغطاء شريحة مربع بحجم 22 مليمتر لتطبيقات المجهر. في بداية هذا الإجراء، يجب تنظيف الشرائح المجهرية وأغطيتها وطلاؤها بعامل كاره للماء. يتم تنظيف الأدوات الزجاجية بغسلها بالأسيتون لمدة خمس دقائق.

بعد الغسيل، تُترك الأدوات الزجاجية لتجف في الهواء. بعد ذلك، يتم تحضير محلول methyl trimethoxy silane بتركيز 2% في الأسيتون، وتُطلى الأدوات الزجاجية في المحلول لمدة دقيقتين. بعد الطلاء، تُزال الأدوات الزجاجية من المحلول وتُترك لتجف.

ثم اشطف الأدوات الزجاجية بـ 70%ethanol باستخدام زجاجة بخاخ. بعد الشطف، اترك الأدوات الزجاجية تجف في الهواء مرة أخرى وقم بإزالة أي سائل متبقٍ. وباستخدام الهواء المضغوط، يمكن تخزين الأدوات الزجاجية المطلية لمدة شهر واحد على الأقل.

بمجرد تجهيز الأدوات الزجاجية، يتم الحصول على بروتينات فلورية سبق تنقيتها كبروتينات ذات وسم his من بكتيريا e coli. قم بقياس طيف الامتصاص للبروتين المنقى. جهز محلول تخفيف مخزون بكثافة بصرية تبلغ حوالي 0.1 في محلول ملحي منظم بـ tris بدرجة pH ثمانية يحتوي على 0.1% bovine serum albumin.

بالإضافة إلى ذلك، قم بتحضير 10 ملليلتر من خليط بنسبة واحد إلى واحد من الأوكتان ومحلول ملحي منظم ثلاثي (tris buffered saline solution) في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر وامزجه بقوة. بعد المزج، اترك الخليط حتى يكتمل فصل الطورين. الطور العلوي هو الأوكتان المستخدم لصنع المستحلب؛ لذا اسحب باستخدام الماصة 45 ميكرولتر من الأوكتان و5 ميكرولتر من البروتين الفلوري في أنبوب epi orph.

انقر على الأنبوب بضع مرات لبدء تكوين المستحلب، ثم قم بمعالجة الأنبوب بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 ثانية في حمام سونيكاتور. في هذه الأثناء، قم بتجهيز شريحة مجهرية مطلية وغطاء شريحة لاستخدامهما بعد عملية السونيكاتور. يجب أن يكون المستحلب عكراً تماماً.

قم بنقل 4 µL من المستحلب فوراً من منتصف الأنبوب باستخدام الماصة إلى شريحة مجهر مطلية، ثم غطِّها بغطاء شريحة مطلي. يجب أن يتوزع المستحلب بشكل متساوٍ بين شريحة المجهر وغطاء الشريحة. ستصبح العينة مستقرة خلال دقائق معدودة.

يعد الإجراء التالي استراتيجية عامة لإعداد تجربة تحويل ضوئي لبروتين فلوري باستخدام مجهر مسح ليزري متحد البؤرة. يمكن تطبيق هذا الإجراء على البروتينات المنقاة وكذلك على الخلايا الحية. في هذه التجربة، تُستخدم عينة قطيرة تحتوي على بروتين m orange two منقى كنقطة بداية عامة لتجربة التحويل الضوئي.

قم بإعداد المجهر البؤري الماسح بالليزر (confocal laser scanning microscope) على النحو التالي. استخدم عدسة شيئية غمر زيتية بفتحة عددية 40 x 1.3، وبحجم صورة 512 في 512 بكسل. اضبط زمن بقاء البكسل (pixel dwell time) على ستة ميكروثانية للمسح، وعامل التكبير (zoom) على أربعة، وقم بزيادة حجم الثقب (pinhole) ليتناسب مع دقة Z تبلغ ثلاثة ميكرونات.

قم بضبط قناتي كشف للفلورة الأولية والمحولة ضوئياً، بالإضافة إلى قناة للتحويل الضوئي. راقب الأنواع البرتقالية باستخدام ضوء إثارة بطول موجي 561 nanometer وجمع الفلورة بين 570 و 630 nanometers. اكشف عن الأنواع الحمراء المحولة ضوئياً باستخدام ضوء إثارة بطول موجي 633 nanometer وجمع الفلورة بين 640 و 700 nanometers.

بالنسبة لقناة التحويل الضوئي، اختر خط الليزر بطول موجي 488 nanometer واجمع الفلورة بين 490 و540 nanometer. التصوير. لا تُعد قناة التحويل الضوئي ضرورية بشكل صارم ولكن يمكن أن تكون مفيدة. لبدء التجربة، استخدم قناة الكاشف لتصوير الفلورة الأولية مع المسح المستمر لضبط قدرة الليزر وكسب الكاشف من أجل الحصول على جودة صورة مثالية.

بعد ذلك، قم بتنشيط قناة التحويل الضوئي واختيار قدرة ليزر منخفضة. ابدأ بتصوير سلسلة زمنية متتابعة وزد قدرة ليزر التحويل الضوئي تدريجياً حتى يُلاحظ تلاشٍ كبير في الفلورة الأولية. استمر في المسح حتى يتلاشى ما يقرب من 75% من الفلورة الأولية.

بعد ذلك، قم بإيقاف تنشيط قناة التحويل الضوئي وتنشيط قناة الكشف عن الفلورة المحولة ضوئياً. ابدأ التصوير باستخدام كسب عالٍ للكاشف مع قدرة ليزر منخفضة. ثم قم بزيادة قدرة الليزر تدريجياً حتى يتم الكشف عن الفلورة المحولة ضوئياً.

بمجرد الكشف، اضبط قدرة الليزر والكشف أو الكسب للحصول على جودة صورة مثالية. وأخيراً، قم بتحسين قدرة الليزر المستخدمة للتحويل الضوئي وكذلك مدتها. سيؤدي زيادة قدرة الليزر إلى تسريع معدل التحويل الضوئي.

ومع ذلك، فإن زيادة قدرة الليزر بشكل مفرط ستؤدي إلى تبييض البروتين ضوئياً. وبمجرد تحديد التحويل الضوئي والقدرة والمدة المثالية لليزر، يمكن استخدام هذه المعلمات لتكوين وحدة تبييض ضوئي قياسية أو وحدة استعادة الفلورة بعد التبييض الضوئي. وعندئذٍ لن تكون قناة التحويل الضوئي مطلوبة نظراً لخصائص الإزاحة الحمراء الطيفية لـ M orange two.

يمكن استخدامه بالتزامن مع البروتين الفلوري الأخضر القابل للتبديل ضوئياً PU للتمييز البصري باستخدام مسبار مزدوج. لبدء عملية التمييز البصري بالمسبار المزدوج، يتم استزراع خلايا hela في أطباق mat tech ذات القاع الزجاجي، ثم تُنقل البلازميدات التي تشفر البروتينات الفلورية إلى الخلايا قبل 24 ساعة من التصوير باستخدام طريقة LIPECTOMY 2000 القياسية للترانسفكشن.

ضع الخلايا الحية على مجهر مسح ليزري بؤري وقم بضبط المجهر لعملية التحويل الضوئي لـ M orange two كما وصفنا سابقاً. ثم قم بتكوين المجهر لعملية التبديل الضوئي لـ DPA. يتم استثارة DPA بضوء طوله الموجي 488 nanometer ويمكن تصوير فلورساته باستخدام قناة التحويل الضوئي لـ M orange two.

تأكد من تقليل قدرة الليزر المستخدمة لتصوير MPA لأن القدرة العالية جداً ستؤدي إلى تعطيل mpa. أضف قناة للتنشيط الضوئي لـ MPA باستخدام إثارة فوتونية ثنائية بطول موجي 800 nanometer، ثم حدد قدرة الليزر المطلوبة لتصوير التنشيط الضوئي والتعطيل الضوئي لفلورية OFA.

يُعد أحد أصعب الجوانب في هذا الإجراء هو تثبيط RPA دون تحويل M orange ضوئياً، وذلك لأن كلا الحدثين يقعان عند نفس الطول الموجي. ومن أجل منع حدوث ذلك، من المهم جداً تحسين عملية التحويل الضوئي بدقة.

قدرة الليزر ومدته. توخَّ الحذر لأن التحويل الضوئي لـ M orange two وتعطيل PU يحدثان عند الإثارة بضوء 488 nanometer؛ لذا يجب تعطيل PU دون حدوث تحويل ضوئي ملموس لـ M orange two. استخدم قدرة ليزر أقل بمجرد تحديد المعايير الخاصة بالتحويل الضوئي لـ M orange two والتبديل الضوئي لـ DPA.

يمكن تحقيق التمييز البصري باستخدام مسبارين. أولاً، يتم تثبيط فلورة DPA في كامل مجال الرؤية باستخدام إثارة منخفضة القوة بطول موجي 488 نانومتر. بعد ذلك، يتم تحديد منطقة الاهتمام وتحويل m orange two باستخدام إثارة عالية القوة بطول موجي 488 نانومتر.

أخيراً، حدد المنطقة المراد دراستها وقم بتنشيط فلورة DPA باستخدام استثارة الفوتونين بطول موجي 800 نانومتر. تُعد عينات قطيرات البروتين الفلوري مناسبة تماماً لإعداد تطبيقات التحويل الضوئي باستخدام المجهر البؤري. عندما يتم تحضير عينة القطيرات بشكل صحيح، تظهر القطيرات متجانسة للغاية.

ومع ذلك، عندما يتم تحضير العينة دون تغطية شريحة المجهر بزجاج غطاء، تميل القطيرات إلى الانضغاط مقابل أحد الأسطح الزجاجية في العينات المحضرة. وفي حالة غياب 0.1%BSA، يميل البروتين الفلوري إلى التراكم عند واجهة الماء الثمانية الواحدة. ويعتمد إنشاء هالة من التحويل الضوئي الفلوري بشكل حاسم على قدرة الليزر ومدة التعرض.

تؤدي قوة الليزر المفرطة أو التعرض لفترة طويلة جداً إلى حدوث التبييض الضوئي، مما يؤدي بدوره إلى انخفاض في الفلورة الحمراء المحولة ضوئياً. تسمح الخصائص الطيفية المتميزة لكل من M orange two وPHO بالتمييز البصري المزدوج للمجسات قبل التحويل الضوئي؛ حيث تُظهر الخلايا التي تعبر عن M orange two وhistone H two B وDPA mito فلورة برتقالية في النواة وفلورة خضراء في الميتوكوندريا. وعندما يتم إيقاف تشغيل جميع الفلورات باستخدام استثارة بطول موجي 488 nanometer وبقوة منخفضة، يكون التحويل الضوئي لـ M orange في حده الأدنى.

يمكن تحويل M orange two ضوئيًا إلى اللون الأحمر باستخدام إثارة عالية الطاقة بطول موجي 488 نانومتر. وبمجرد تحويل M orange two ضوئيًا، يمكن إعادة تشغيل فلورة drawn puff باستخدام إثارة فوتونية ثنائية بطول موجي 800 نانومتر. وباستخدام التمييز البصري بالمسبار المزدوج، يمكن وسم الخلايا بأربع طرق متميزة.

باستخدام هذه التقنية، يمكن وسم أربع مجموعات خلوية مختلفة بشكل محدد. وكما رأيتم، فإن أحد أصعب الجوانب في هذا الإجراء هو تعطيل MPA دون تحويل m orange ضوئياً. وبمجرد إتقان ذلك، يمكن إجراء تجارب إضافية باستخدام هذا النظام، على سبيل المثال، تتبع مجموعات متعددة في خلايا بيتا البنكرياسية.

هذا كل شيء. آمل أن تكونوا قد وجدتم هذا العرض مفيداً، ومع تمنياتي لكم بالتوفيق في تجاربكم.