تقنيات التصوير كاليفورنيا ^{2 +} في اشارة الى الحيوانات المنوية البشرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على سلاسل صور لحيوانات منوية بشرية مثبتة وموسومة بصبغة فلورية كاشفة للكالسيوم. يتم عزل الخلايا المتحركة من البلازما المنوية عن طريق جعلها تسبح للأعلى في وسط حضانة. وبعد عملية التأهيل (capacitation)، يتم وسم الخلايا بمؤشر الكالسيوم الفلوري، ثم تُنقل إلى غرفة تصوير قابلة للدمج، مثبتة على مجهر فلوري مقلوب.

يتم التقاط استجابات تركيز أيونات الكالسيوم كسلسلة من الصور بفاصل زمني، ثم تُحلل لاستخراج استجابات الخلايا المفردة. مرحباً، أنا إدوين أندريس موراليس غارسيا من مختبر الدكتور ستيفن جيه. بوبليك كوفا في كلية العلوم الحيوية بجامعة برمنجهام في المملكة المتحدة. وأنا كاثرين ناش، من مختبر بوبليك أيضاً.

وأنا جينيفر موريس من مختبر Public Overlap. سنوضح لكم اليوم إجراء تصوير استجابات الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا النطفية البشرية الفردية. نحن نستخدم هذا الإجراء داخل مختبرنا لدراسة تنظيم أنشطة الحيوانات المنوية باستخدام محفزات مشتقة من البويضة والسبيل الأنثوي.

لنبدأ الآن. تُخزن عينات السائل المنوي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة من لحظة الجمع لعزل الخلايا الحركية من البلازما المنوية. يتم وضع 1مل من محلول L'S balance salt solutions المكمل بـ 0.3% BSA، والذي يُرمز له اختصاراً بـ S-E-B-S-S، في سلسلة من أنابيب البوليسترين ذات القاع المستدير سعة 5مل. يُضاف 0.3مل من السائل المنوي برفق فوق محلول S-E-B-S-S في كل أنبوب، ثم يُغلق الأنبوب بغطاء غير محكم.

قم بتحضين الأنابيب بزاوية 45 درجة لمدة ساعة واحدة عند 37 °C و6% carbon dioxide. للسماح للخلايا المتحركة بالسباحة إلى الأعلى في S-E-B-S-S، اسحب بلطف أعلى 0.7 milliliter من المحلول، ثم اسحب المحلول من جميع الأنابيب إلى أنبوب طرد مركزي من البوليسترين سعة 15 milliliter ونظيف. رج الأنبوب بلطف للمزج، ثم قم بعد الخلايا التي تم تثبيتها باستخدام الفورمالين في غرفة عد خلايا جديدة.

اجعل التركيز 6 مليون خلية لكل milliliter في S-E-B-S-S وقسم الحيوانات المنوية إلى حصص قدرها 200 µL في أنابيب بوليستيرين ذات قاع مستدير سعة خمسة milliliter. أغلق الأغطية بشكل غير محكم. إذا كانت الدراسة تستهدف استجابة الخلايا التي خضعت للتأهيل، فقم بحضن الأنابيب لمدة تتراوح من خمس إلى ست ساعات عند 37 °C و6% carbon dioxide للسماح بعملية التأهيل. ضع 10 µL من polylysine بتركيز 10% على شكل عدة قطرات صغيرة في مركز شريحة مقاس 22 × 50 millimeter.

ضع شريحة غطاء رقم واحد واتركها تجف تماماً. استخدم شحم الفراغ لتثبيت شريحة الغطاء بحيث يكون الجانب المعالج موجهاً للأعلى في غرفة تصوير قابلة للصهر مصممة لهذا الغرض.

لكل تجربة تصوير، اختر أنبوبًا واحدًا من الخلايا ذات القدرة الإخصابية وأضف 1.2 µL من مادة Calcium dependent organ green بتركيز 2.5 mg/mL المذابة في DMSO للوصول إلى تركيز نهائي قدره 10 µM. حضّن الأنبوب لمدة 40 دقيقة عند 37 °C و6% CO2.

باستخدام ماصة Pepto سعة 200 ميكرولتر مع رأس P 200، قم بإزالة كل المحلول من الأنبوب تماماً. املأ الغرفة عن طريق الحقن برفق في منفذ التدفق الداخل. أَمِل الغرفة بحيث تخرج الفقاعات عبر منفذ التدفق الخارج.

ضع الغرفة بأكملها في الحاضنة واتركها لمدة 20 دقيقة إضافية عند 37 درجة Celsius و6% carbon dioxide، وذلك للسماح للحيوانات المنوية بالالتصاق بـ poly D lysine. ثبت الغرفة على المجهر الفلوري المقلوب وقم بتوصيلها بجهاز التروية.

اترك التحضير في الظلام لمدة 10 دقائق على الأقل للسماح لسائل التروية بالانجراف. افحص الخلايا السائبة والمادة خارج الخلوية تحت مجهر تباين الأطوار بتكبير 40 x أو 60 x، واختر مجال رؤية يكون فيه التباعد بين الخلايا كافياً للسماح بتقييم الفلورة لكل خلية على حدة. يجب أن تكون الخلايا ملتصقة بشكل كافٍ، ويفضل أن تُظهر نشاطاً واضحاً في تكوين الأهداب.

قم بتحويل المجهر إلى القناة الفلورية الخضراء. حافظ على أزمنة التعريض عند الحد الأدنى المطلوب للحصول على صورة فلورية واضحة، وذلك لتقليل التبييض الضوئي في برنامج IQ.

قم بتنشيط عملية الحصول على الصور في سلسلة زمنية. يتم الحصول على الصور بتردد 0.1 hertz مع استخدام غالق يتم التحكم فيه برمجياً للحد من الإضاءة. ابدأ التسجيل لفترة ضابطة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق، ثم قم بمعالجة تركيز الكالسيوم في المحلول الملحي وتطبيق العقاقير عن طريق تغيير المحلول الملحي عند رأس نظام التروية.

دوّن الوقت الذي يتم فيه إضافة كل محفز إلى الترويسة واحسب وقت وصوله إلى الغرفة كما هو موضح في الجزء المكتوب من هذا البروتوكول. لتحليل الصور دون اتصال بالإنترنت، استخدم إحدى أدوات الرسم لتحديد منطقة اهتمام أو ROI حول كل خلية أو جزء من خلية، وهنا نحدد رأس الحيوان المنوي الخلفي لأن الكالسيوم المخزن يتم تعبئته في هذه المنطقة. استخدم شريط التمرير لمراجعة سلسلة الصور.

حدد وقم بإزالة الخلايا التي تفشل في البقاء بالكامل ضمن منطقة الاهتمام (ROI)، أو التي تتداخل مع خلايا أخرى، أو التي أظهرت زيادة كبيرة وسريعة في شدة الفلورية يتبعها انخفاض حاد، وهو ما يميز موت الخلايا. استخدم وظيفة التحليل (analyze) لإنشاء سلسلة زمنية لشدة الفلورية لكل منطقة اهتمام. ويمكن بعد ذلك تصدير البيانات وتحليلها في ورقة بيانات.

هذه الصور مأخوذة من سلسلة تم الحصول عليها أثناء التحفيز باستخدام 3 µM من البروجسترون. تم تلوين الصف السفلي بألوان زائفة. ولتوضيح التغيرات في الكثافة النسبية بشكل أفضل، دخل البروجسترون إلى الحجرة هنا.

تم عرض هذه النتائج في فيديو بنظام التصوير المتقطع (time-lapse). لاحظ الارتفاع السريع في كثافة الفلورة المتبوع بزيادة بطيئة، مما يشير إلى التغيرات المقابلة في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا. تم قياس هذه البيانات هنا بناءً على متوسطات الكثافة للجزء الخلفي من الرأس لثلاث خلايا.

تمت إضافة البروجسترون بتركيز 3 micromolar في الوقت المحدد بالسهم. ويمثل الخط المتقطع متوسط الفلورية للمجموعة الضابطة. لقد عرضنا لكم اليوم كيفية عزل خلايا عالية الجودة، وتحميلها بصبغة حساسة للكالسيوم، ومراقبة استجابة كل خلية على حدة للتحفيز.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام أفضل مجموعة خلوية ممكنة، وكذلك تقليل تعريض الخلايا للإضاءة لتجنب التلف الضوئي، واختيار الصبغة التي تناسب الاستجابات التي تبحث عنها بشكل أفضل. هذا كل شيء. شكرًا للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.