Name: على نطاق واسع من شاشات مكتبات Metagenomic (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 5 s
Description: تعلم تقنية التلقيح الآلي للمستعمرات الميكروبية على أغشية النايلون باستخدام الروبوتات في دراسات الميتاجينوم. هذه الطريقة تتيح زرع 10000 مستعمرة بدقة عالية وتقلل الأخطاء البشرية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. التهجين الداخلي وسوف تتخذ أنبوب واحد التهجين 1 أو 2 الأغشية (حجم 22 من 22 سم). استخدام 50 مل من مزيج التهجين و 0.5 ملغ من الحمض النووي التحقيق (10 نانوغرام / مل تركيز النهائي) في أنبوب التهجين. للحصول على أفضل النتائج ، استخدم هلام تنقية الحمض النووي والتحقيق. إذا رفع مستوى إعداد التحقيق ، وزيادة عدد من أنابيب بدلا من زيادة كمية المواد الكاشفة في الأنبوب. إعداد المسبار (0.5 ملغ DNA) : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 15 ميكرولتر عبر رابط حل مع 60 ميكروليتر من الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع DNA إلى 10 نانوغرام / ميكرولتر مع الماء لحجم إجمالي 50 ميكرولتر في microtube المسمار المغطاة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفسد الحمض النووي لمدة 5 دقائق في الماء المغلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بسرعة إلى جليد والسماح لتبرد لمدة 5 دقائق. تدور لفترة وجيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر العازلة للتفاعل ومزيج بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 10 ميكرولتر من العلامات كاشف ومزيج بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكروليتر من الحل عبر رابط المخفف من الخطوة (1) ومزيج بلطف. وتدور الدوامة برفق لفترة وجيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبقي على الجليد لمدة تصل إلى 2 ساعة أو إضافة حجم مساو من الجلسرين 100 ٪ وتخزينها في -20 درجة مئوية. ملاحظة : استخدام المياه المتوفرة مع الطقم. إبقاء كل الكواشف على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك. </li></ol> إعداد الغشاء والتهجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سخن 50 مل من العازلة التهجين والتهجين أنبوب إلى 60 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى تهجين العازلة أنبوب التهجين. نشمر عن غشاء (ق) وإضافة إلى أنبوب التهجين. (إذا مضيفا 2 الأغشية في الأنبوب ، ولفة واحدة first الغشاء تماما ، ولفة بعد ذلك الغشاء الأخرى على أعلى في نفس الاتجاه.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان أنبوب التهجين عند 60 درجة مئوية لمدة نصف ساعة على الأقل (تأكد من الحصول على غارقة غشاء (ق) بدقة.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل حوالي 1 مل من التهجين مع العازلة ماصة طويلة من التهجين أنبوب إلى أنبوب يحتوي على التحقيق المسمى. وتدور الدوامة برفق لفترة وجيزة. نقل الخليط مرة أخرى إلى أنبوب التهجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 60 درجة مئوية خلال الليل. ملاحظة : استخدم ملقط والقفازات عند التعامل مع الأغشية. مزيج من المحتوى أنابيب التهجين بلطف لأن الكثير من الإثارة تسبب تشكيل رغوة دائمة غير مرغوب فيها. وينبغي أن يضاف الأغشية في حالة رطبة ؛ نقع في المخزن التهجين أو الماء إذا لزم الأمر وتصريف السائل الزائد قبل ان يضيف. </li></ol> 2. الكشف الداخلي غسل الأغشية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سخن العازلة الغسيل الابتدائي إلى 60 درجة مئوية. (استخدام المايكرويف و / أو لوحة التسخين.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان هناك 2 الأغشية في التهجين أنبوب واحد ، نقل أحد إلى الغشاء ، مسخن نظيفة ، وتهجين أنبوب فارغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف لفترة وجيزة أنبوب التهجين مع حوالي 50 مل من غسل العازلة الأولية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف حوالي 100 مل من المخزن الرئيسي لغسل أنبوب التهجين واحتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 3 و 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل غشاء لغسل الحاويات واحتضان مع ما لا يقل عن 250 مل من غسل العازلة الثانوية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 6. ملاحظة : يمكن الاحتفاظ الأغشية العازلة في غسل الثانوية في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى ساعة ونصف قبل توليد الإشارات. </li></ol> توليد الإشارات والكشف عن (إجراء لمدة الغشاء) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريط قطعتين من SaranWrap شقة على سطح الطاولة (واحد للخطوة 2 واحدة للخطوة 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنزاف بعناية قبالة عازلة الفائض من الغشاء عن طريق لمس زوايا الغشاء ضد الجانب من الحاويات ونقل الغشاء على لSaranWrap (الجانب عينة متابعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 6-7 مل من كاشف ECF على الغشاء وأمثالها على مدى التفاف ساران الغشاء. توزيع بعناية كاشف ECF على الغشاء عن طريق تحريك بلطف Kimwipe خلال SaranWrap. احتضان لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصريف فائض كاشف ECF من الغشاء ونقلها إلى SaranWrap جديدة ، والتفاف أضعاف خلال الغشاء ، وختم حواف مع الشريط. تغطية غشاء بورق الألمنيوم. احتضان لمدة 1-2 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحة زجاج الماسحة الضوئية عن طريق توزيع 1-2 مل من كاشف ECF على لوحة زجاجية. ثم نقل الغشاء على لوحة من الزجاج (الجانب عينة لأسفل) وتوزيع آخر مل من كاشف 1-2 ECF على الغشاء. تراكب مع SaranWrap ودفع بعناية جميع فقاعات الهواء بعيدا عن الغشاء. (يمكنك وضع لوحة شديدة على رأس SaranWrap للحفاظ على غشاء تضغط على لوحة من الزجاج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام FLA - 5100 الماسح الضوئي مضان فوجي (&quot;1 1 صورة ليزر&quot; واسطة) مع الإعدادات التالية : الإثارة 473 نانومتر ، والكشف عن تصفية LPB (510 نانومتر) ، والقرار 50 ميكرون ، 16 بت التخرج إشارة ، CH1 400 V. (المسح الضوئي يستغرق حوالي 15-20 دقيقة في غشاء من حجم 22 سم بحلول 22). اختياري : </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا الجلوس لمدة 2-4 ساعات (أو أكثر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار الفحص كما في الخطوة 6. </li></ol> 3. تجريد وتخزين الداخلي (NUF إصدار) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غشاء نقل آخرون إلى 100 ٪hanol ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الطازجة الإيثانول بنسبة 100 ٪ واحتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. (قد تبقى في غشاء الايثانول لعدة أيام.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الإيثانول مع الماء المقطر ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 مل من الماء و 5 مل من 10 ٪ SDS (SDS النهائية 0.5 ٪) إلى أنبوب التهجين والمزيج بلطف. إضافة الغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في احتضان 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غشاء نقل إلى حاوية نظيفة وفارغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 مل من الماء و5 مل من 10 ٪ SDS (SDS النهائية 0.1 ٪) كوب والحرارة ليغلي قوية في المايكرويف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب القريبة من الغليان حل SDS 0.1 ٪ خلال الغشاء وتستنهض الهمم بلطف لعدة دقائق. السماح لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في شطف لا يقل عن 250 مل من 100 درجة الحموضة العقيمة تريس 8 مم على الأقل 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفاف في الغشاء SaranWrap وحواف وثيق مع الأشرطة بعناية. المحل في 4 درجات مئوية. (يجب أن لا تجف الأغشية). </li></ol>

لم يتم تجريد الإجراء الأمثل. ومع ذلك ، فإن الإجراء الوارد في تجريد تعليمات الشركة المصنعة (2 يغسل كل من ، في 10 دقيقة في الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، و 1 من 1 يغسل ساعة عند 60 درجة مئوية في 0.5 ٪ SDS) غير كافية. على الأقل الحضانة بين عشية وضحاها في الإيثانول بنسبة 100 ٪ من الضروري حل ناتج التفاعل ECF ؛ عدة أيام الحضانة في الإيثانول بنسبة 100 ٪ ويبدو أن له أي آثار سلبية على القدرة على reprobe الغشاء. الشركة المصنعة SDS العلاج ويبدو أيضا أن تكون كافية. وقد حاولت NUF 1 ساعة عند 80 درجة مئوية مع 0.5 ٪ SDS تليه...

الجمع بين حزمة RPN3692 = RPN3680 + RPN3685

على نطاق واسع من شاشات مكتبات metagenomic

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

أرشيف المكتبات Metagenomic شظايا كبيرة من تسلسل الجيني متجاورة من الكائنات الدقيقة دون الحاجة إلى زراعة السابقة. توليد إجراء مبسط لإنشاء مكتبات والفرز metagenomic بالتالي مفيدة للتحقيقات عالية الكفاءة الإنتاجية في الخصائص الوراثية والتمثيل الغذائي لتجمعات الجراثيم غير مثقف. هنا ، تعرض البروتوكولات الرئيسية في الفيديو ، الذي نقترحه هو الشكل الأكثر فائدة لوصف دقيق لعملية طويلة تعتمد على الأجهزة الروبوتية بالتناوب والتدخلات اليدوية (الإنسان). أولا ، استخدمنا الروبوتات على الفور على استنساخ مكتبة macroarray الأغشية ذات الكثافة السكانية العالية ، كل منها يمكن أن تحتوي على المستعمرات مكررة 20-4 لوحات المكتبة 384 أيضا. أتمتة أمر ضروري لهذا الإجراء ليس فقط من أجل الدقة والسرعة ، ولكن أيضا بسبب صغر الحجم المطلوب لاحتواء عدد كبير من الحيوانات المستنسخة في مكتبة الترتيبات المكانية كثيفة للغاية. ولدت مرة واحدة ، ونحن تظاهر القادمة كيف يمكن فحص الأغشية macroarray عن الجينات ذات الاهتمام باستخدام نسخ معدلة من البروتوكولات القياسية لوسم التحقيق التهجين الغشاء ، والكشف عن الإشارة. نحن تستكمل المظاهرة البصرية من هذه الإجراءات مع أوصاف مكتوبة مفصلة من الخطوات المعنية والمواد المطلوبة ، وكلها متاحة على شبكة الإنترنت جنبا إلى جنب مع الفيديو.

على نطاق واسع من شاشات مكتبات Metagenomic

تعمل المكتبات الميتاجينومية على أرشفة قطع كبيرة من التسلسلات الجينومية المتجاورة من الكائنات الدقيقة دون الحاجة إلى استزراعها مسبقاً. إن إنشاء...

هدفنا هنا هو تلقيح مستعمرات من بعض هذه المكتبات الميتاجينومية على مرشحات غشائية، ويمكن لكل مرشح من هذه المرشحات استيعاب 10,000 مستعمرة. لذا، ما نقوم به الآن هو وضع هذا المرشح النايلوني على كتلة وتسويته. إنه مغمور في كمية قليلة من السائل، وهو مجرد وسط النمو luria broth.وبعد ذلك، سيقوم بنقل هذا الغشاء المرطب إلى الروبوت الذي سيقوم تلقائياً بتلقيح هذا الغشاء بـ 10,000 مستعمرة. وتعد الروبوتات ضرورية لهذا النوع من الإجراءات لأنه لا يملك أي إنسان بالفعل الصبر أو الدقة اللازمة لتنقيط 10,000 مستعمرة على أحد هذه الأغشية. إن الروبوتات هي أحد الأشياء التي ساهمت فعلياً في تطوير علوم الجينوم من خلال السماح بإجراء عمليات تكرارية للغاية وبمقاييس مكانية صغيرة بدقة عالية.في الوقت الحالي، يتم إعداد الروبوت لتغذية هذه الأطباق الثلاثة ذات الـ 84 بئراً، حيث يحتوي كل بئر في تلك الأطباق الـ 84 بئراً على مستعمرة فردية من المكتبة الميتاجينومية. حالياً، يقوم الروبوت بتعقيم إبر التلقيح التي سيستخدمها للنقط على الغشاء. لذا فهي تمر عبر عدة محاليل مختلفة، أحدها هو 70% ethanol لتعقيمها، ومن ثم سيتم غمس إبر التلقيح هذه في طبق 84 بئراً يحتوي على جميع المستعمرات.يتم الآن تعقيمها وتجفيفها بواسطة الضوء. وبعد تجفيف إبر التلقيح، سيتم تمرير طبق عبر الروبوت. في الواقع، يتم سحب عينة من كل مستعمرة من هذه المستعمرات ومضاعفت

large-scale-screens-of-metagenomic-libraries

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يصف هذا البروتوكول شاشة إنتاجية عالية للنشاط cellulolytic من مكتبة metagenomic أعرب في القولونية. الشاشة هو حل قائم ومؤتمتة للغاية ، ويستخدم واحد في 384 وعاء الكيمياء microplates جيدا مع قراءات النهائي باعتبارها قياس الامتصاصية.

شاشة إنتاجية عالية للنشاط Biomining سلولاز من مكتبات Metagenomic

قمنا بتطوير شامل وغير متحيز الجينوم واسعة لفهم الجينات شاشات المخدرات وتفاعلات الجينات والبيئة. وتعرض وسائل للكشف عن هذه المجموعات متحولة.

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

المصدر: كيم، ه. وآخرون، الفحص متعدد الإنزيمات باستخدام نظام فحص إنزيمات جينية عالي الإنتاجية. J. Vis. Exp. (2016)يوضح هذا الفيديو طريقة فحص جيني للكشف عن تعبير الإنزيمات باستخدام مكتبات فوسميدات ميتاجينومية وركائز كروموجينية. يحدد التدفق الخلوي ويعزل الخلايا المفردة المنتجة منتجات ملونة، مما يتيح اختيار عالي الإنتاجية للخلايا النشطة المعبرة عن الإنزيمات.

الكشف عن تعبير الإنزيم المستهدف في الخلايا البكتيرية المعدلة وراثيا

تصف هذه المخطوطة نهجا آليا لاختيار حجم الهلام لتنقية شظايا الحمض النووي لتسلسل الجيل التالي. توفر تقنية رينجر أتمتة كاملة للعملية الكاملة لتحميل هلام الاغاروز ، والتحليل الكهربائي ، واستعادة شظايا الحمض النووي المستهدفة مما يسمح بمكتبات تسلسل عالية الإنتاجية وعالية الجودة من الجيل التالي.

جل الآلي الحجم التحديد لتحسين نوعية المكتبات تسلسل الجيل المقبل من إعداد من عينات المياه البيئة

يقدم هذا العمل طريقة للفحص عالي الإنتاجية باستخدام نظام فحص إنزيم جيني عالمي يمكن تطبيقه نظريا على أكثر من 200 إنزيم. هنا ، يحدد نظام الفحص الفردي ثلاثة إنزيمات مختلفة (الليباز ، السليلوز ، والفوسفاتيز القلوي) ببساطة عن طريق تغيير الركيزة المستخدمة (أسيتات p-nitrophenyl ، p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ، وفوسفات فينيل).

متعدد انزيم الفحص باستخدام عالية الإنتاجية نظام فحص انزيم الوراثية

تم استخدام  Metagenomics للتحقيق في ميكروبيوم علف ماشية السيلاج. تم إجراء التحليل عن طريق تسلسل البندقية. تم استخدام هذا النهج لتوصيف تكوين المجتمع الميكروبي داخل علف الماشية.

تحليل Metagenomic من السيلاج

تحديد التفاعلات الفيزيائية بين الجينات والعناصر التنظيمية الصعبة ولكن قد تيسرت بفضل أساليب التقاط تكيف كروموسوم. هذا التعديل على البروتوكول ج 4-seq يخفف التحيز PCR بالتقليل من التضخيم المفرط لقوالب بكر ويزيد من مابابيليتي لما يلي: عن طريق إدراج خطوة هضم إنزيم التقييد بإضافة.

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

توفر تقنية CRISPR-Cas9 طريقة فعالة لتحرير الجينوم الثدييات بدقة في أي نوع من أنواع الخلايا وتمثل وسيلة جديدة لأداء الشاشات الوراثية على نطاق الجينوم. ويرد هنا بروتوكول مفصل يناقش الخطوات اللازمة للنجاح في أداء شاشات كريسبر-كاس9 المجمعة على نطاق الجينوم.

الشاشات الوراثية المجمعة المستندة إلى كريسبر في خلايا الثدييات

تصف هذه المخطوطة نهج فحص قائم على الخلايا على نطاق الجينوم لتحديد تفاعلات مستقبلات ligand خارج الخلية.

التعرف على مستقبلات سطح الخلية باستخدام شاشات CRISPR/Cas9 الجينية على مقياس الجينوم

تقدم هذه الدراسة بروتوكول متعدد الأومور المكاني Trekker–CUT&amp;Tag يجمع بين الترميز المكاني المباشر لقسم النسيج وتحليل متعدد الخلايا أحادية الخلية. يتيح هذا النهج من تحديد عرض الخلايا الواحدة وتعديل هيستون H3K27ac بشكل مكاني في نفس الوقت، مما يوفر رؤى ميكانيكية حول تنظيم الجينات في سياق تشريح الأنسجة الدقيق.

تم تحديد الأنماط متعددة الأبعاد أحادية الخلية والمتكاملة للنسخ والأهداف فوق الجينية في مقاطع الأنسجة المجمدة

تعلم تقنية التلقيح الآلي للمستعمرات الميكروبية على أغشية النايلون باستخدام الروبوتات في دراسات الميتاجينوم. هذه الطريقة تتيح زرع 10000 مستعمرة بدقة عالية وتقلل الأخطاء البشرية.

على نطاق واسع من شاشات مكتبات Metagenomic

استكشف المزيد من الفيديوهات