قياس صلابة انحناء الخلايا البكتيرية باستخدام فخ البصرية

لتحديد صلابة الانحناء لخلايا coli الفردية، قم أولاً بتنمية البكتيريا حتى تصل إلى طور النمو الأسي، ثم قم بتثبيتها على سطح شريحة تغطية معالجة كيميائياً. اترك الخلايا المثبتة مسبقاً على السطح لتنمو أكثر بحيث تطور نهايات مرنة. بعد ذلك، قم بتدفق الخرزات العازلة كهربائياً، ثم احجز خرزة وقم بثنيها باتجاه الطرف المرن للخلية.

تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في ثني الخلية باستخدام المصيدة البصرية وقياس بيانات الإزاحة القسرية الناتجة. ويمكن حساب جساءة الثني للخلية من خلال إجراء ملاءمة خطية لبيانات الإزاحة القسرية. مرحباً، أنا ستيفن وونغ من مختبر البروفيسور جوشوا شير في معهد لويس سيكلر للجينوميات التكاملية وقسم الفيزياء في جامعة برينستون.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لثني خلايا بيضاوية فردية وقياس صلابة الخلية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة مساهمات الهياكل المختلفة داخل الخلايا في السلامة الميكانيكية للخلايا البكتيرية. لذا، لنبدأ.

لبدء هذا الإجراء، قم بتنمية ثلاثة ملليلتر من أي خلايا e coli في وسط LB حتى تصل إلى طور النمو الأسّي. وبمجرد أن تصل الخلايا إلى كثافة ضوئية عند 600 نانومتر تتراوح بين 0.2 و 0.4، أضف إلى المزرعة 50 ميكروغرام per ملليلتر من cephalexin لمدة 15 دقيقة لتحفيز النمو الخيطي. وخلال هذه الـ 15 دقيقة، قم بتجهيز غرفة التدفق.

قم بلصق قطعتين من الشريط اللاصق ذي الوجهين على شريحة زجاجية مع ترك فجوة قدرها 3 mm بين القطعتين، ثم قم بتثبيت غطاء الشريحة في الأعلى باستخدام الشريط اللاصق. وتعمل الفجوة الموجودة بين قطعتي الشريط على تكوين قناة لتدفق السائل. قم بطلاء غطاء الشريحة بـ PEI عن طريق سحب 10 µL من polyethaline بتركيز 1% مخفف في الماء إلى غرفة التدفق باستخدام ماصة دقيقة، ثم اتركها للحضن لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، يتم الغسل عن طريق تدفق 200 µL من الماء عند أحد طرفي الغرفة وجمعها من الطرف الآخر باستخدام المكنسة الكهربائية (vacuum). وبعد نمو البكتيريا لمدة 15 دقيقة في وجود cephalexin، يتم تدوير ملليلتر واحد من الخلايا في جهاز طرد مركزي دقيق (micro centrifuge) وإعادة تعليقها في 200 µL من LV مع cephalexin. تالياً، وبطريقة مماثلة، استخدم ماصة دقيقة عند أحد الطرفين والمكنسة الكهربائية عند الطرف الآخر لتدفق 50 µL من مزرعة الخلايا المركزة إلى الغرفة التي تحتوي على شريحة التغطية المطلية، ثم يتم التحضين لمدة ثلاث دقائق.

ثم يتم الغسل باستخدام 50 µL من وسط Vel B المضاف إليه cephalexin. ولإزالة الخلايا غير الملتصقة، يتم تحضين الغرفة عند 37 °C لمدة تتراوح بين 30 دقيقة وساعة واحدة للسماح للخلايا الملتصقة بالنمو قبل وضعها في جهاز المصيدة البصرية أثناء تحضين الخلايا. ويتم تحضير حبيبات مطلية بالبولي ليسين عن طريق تحضين 3 µL من حبيبات البوليسترين ذات قطر 0.5 µm في محلول Polylysine بتركيز 0.1% مخفف في الماء لمدة 30 دقيقة.

عند انتهاء فترة تحضين الخرز، يتم غسله ثلاث مرات عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي دقيق ثم إعادة تعليقه في 1 mL من الماء، ثم يتم المضي قدماً في ربط الخرز بالبكتيريا وقياس صلابة ربط الخلايا. إن الجانب الأكثر صعوبة في هذا البروتوكول هو القدرة على تحديد وتحديد موقع والتعرف على خلية مناسبة لقياسات صلابة الانحناء. والخلية المناسبة هي تلك التي تمتلك طرفاً مثبتًا وطرفاً حراً محددين بوضوح.

ابحث في غرفة التدفق الموجودة على المجهر عن خلية ذات طرف مثبت بدقة. تلتصق بعض الخلايا عند طرف واحد فقط، مما يؤدي إلى دوران الخلية بأكملها بدلاً من انحنائها نتيجة قوة الانحناء عند الطرف الآخر. وللعثور على خلية مناسبة، قم بثني كل خلية بسرعة باستخدام المصيدة من خلال تحريك المنصة الذي يتم التحكم فيه بواسطة عصا التحكم.

عند العثور على خلية مناسبة، يتم تخفيف محلول الخرز بمقدار الضعف في وسط LB مع السيفالكسين، ثم تُضاف 30 microliters من محلول الخرز إلى غرفة التدفق عن طريق التنقيط في أحد الطرفين وجعلها تتدفق برفق من الطرف الآخر باستخدام منديل Kim wipe، ثم يتم اصطياد خرزة عائمة بصرياً وتلامسها مع الطرف الحر للخلية. تُغسل الغرفة مرة أخرى بواسطة الماصة الدقيقة وباستخدام منديل Kim white مع 50 microliters من السيفالكسين في وسط LB لإزالة الخرز غير الملتصق. بعد ذلك، يتم تشغيل برنامج LabVIEW مكتوب خصيصاً لتطبيق قوى الانحناء على الخلية وتسجيل بيانات الإزاحة القسرية.

أولاً، قم بمعايرة استجابة الكاشف عن طريق إجراء مسح RA للخرزة المتصلة ضمن شعاع ليزر الكشف وتسجيل إشارات جهد PSD ثلاثية الأبعاد. ثم حدد المحور الطولي للخلية في صورة مجهرية. بعد تحديد المحور الطولي للخلية، حرك الخلية في خطوات باتجاه عمودي على المحور الطولي، وأثناء تحريك الخلية، سجل المسافة المقطوعة وإزاحة الخرزة عن مركز المصيدة البصرية.

أخيراً، قم بتحويل قيم الإزاحة إلى القوة المؤثرة باستخدام صلابة المصيدة المقاسة مسبقاً ثم احفظ النتائج. تمثل إزاحة الرأس والقوة المحفوظة في الملف هنا بيانات الإزاحة القسرية لخلية واحدة. ويمثل ميل هذا الخط صلابة الانحناء للخلية.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية دمج صلابة الانحناء لبكتيريا e coli مع المصيدة الضوئية. عند استخدام هذا الإجراء، من المهم تذكر العثور على خلية جيدة ذات طرف مثبت وطرف حر محددين بوضوح. وهذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.