قياس صلابة انحناء الخلايا البكتيرية باستخدام فخ البصرية
April 26th, 2010
نقدم بروتوكولا للخلايا بكتيرية الانحناء الخيطية تعلق على سطح الغطاء للانزلاق مع اعتراض الضوئية لقياس صلابة الخلوية الانحناء.
من أجل تحديد صلابة الانحناء لخلايا القولونية الفردية ، أولا ، قم بتنمية البكتيريا إلى المرحلة الأسية ثم ربطها بسطح انزلاق غطاء معالج كيميائيا. دع الخلايا تلتصق بالفعل بالسطح تنمو بشكل أكبر بحيث تطور نهايات مرنة. التدفق التالي في حبات عازلة ، واصطياد حبة وثنيها إلى الطرف المرن للخلية.
تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في ثني الخلية باستخدام المصيدة البصرية وقياس بيانات الإزاحة القسرية الناتجة. يمكن حساب صلابة الانحناء للخلية من خلال ملاءمة خطية لبيانات الإزاحة القسرية. مرحبا ، أنا ستيفن وونغ من مختبر البروفيسور جوشوا شير في معهد لويس سيكلر لعلم الجينوم التكاملي وقسم الفيزياء في جامعة برينستون.
سنعرض لك اليوم إجراء ثني الخلايا البيئية الفردية وصلابة الخلية المتزوجة. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة مساهمات الهياكل المختلفة داخل الخلايا في السلامة الميكانيكية لخلايا البكتيريا. لذلك دعونا نبدأ.
لبدء هذا الإجراء ، قم بزراعة ثلاثة ملليلتر من أي خلايا بكترية قولونية في المرحلة المتوسطة إلى المرحلة الأسية. بمجرد أن تصل الخلايا إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر تتراوح بين 0.2 و 0.4 ، استكمل المزرعة ب 50 ميكروغرام لكل مليلتر من السيفاليكسين لمدة 15 دقيقة للحث على النمو الخيطي. خلال هذه ال 15 دقيقة ، قم بعمل غرفة تدفق.
قم بإرفاق قطعتين من الشريط على الوجهين بفجوة ثلاثة ملليمترات بين القطع بشريحة زجاجية وقم بلصق زلة غطاء في الأعلى. تخلق الفجوة بين قطع الشريط قناة للسائل المتدفق. قم بتغطية زلة الغطاء ب PEI عن طريق تدفق 10 ميكرولتر من البولي إيتالين المخفف في الماء بنسبة 1٪ في غرفة التدفق باستخدام ماصة صغيرة تحتضن لمدة خمس دقائق.
ثم اغسل عن طريق تدفق 200 ميكرولتر من الماء في أحد طرفي الغرفة وتجميعها في الطرف الآخر باستخدام فراغ. بعد 15 دقيقة من زراعة البكتيريا في وجود السيفاليكسين ، قم بتدوير مليلتر واحد من الخلايا في جهاز طرد مركزي صغير وإعادة تعليقه في 200 ميكرولتر من LV مع السيفاليكسين. بعد ذلك ، مرة أخرى ، استخدم ماصة صغيرة على أحد طرفيها وقم بالتفريغ على الطرف الآخر لتدفق 50 ميكرولترا من ثقافة الخلايا المركزة إلى الغرفة التي تحمل حضنة زلة الغطاء المطلي لمدة ثلاث دقائق.
ثم يغسل ب 50 ميكرولتر من Vel B مع السيفاليكسين. لإزالة الخلايا غير المتصلة ، احتضان الغرفة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة للسماح للخلايا المرفقة بالنمو قبل وضعها على أداة الاصطياد البصري أثناء احتضان الخلايا. قم بإعداد حبات مطلية بالبولي ليسين عن طريق احتضان ثلاثة ميكرولترات من حبات البوليسترين بقطر 0.5 ميكرومتر في واحدة من 0.1٪ بوليسين مخفف في الماء لمدة 30 دقيقة.
عندما تنتهي الخرزات من الحضانة ، اغسلها ثلاث مرات عن طريق الدوران لأسفل في جهاز طرد مركزي دقيق وتعليق المجدد في مليلتر واحد من الماء ، واستمر في ربط الخرزات بالبكتيريا وقياس صلابة ربط الخلايا. أصعب جانب في هذا البروتوكول هو القدرة على تسجيل خلية جيدة وتحديد موقعها والتعرف عليها لقياسات الانحناء والتصلب. والخلية الجيدة هي الخلية ذات النهاية العالقة المحددة جيدا ومكان نهاية حرة.
تبحثغرفة التدفق على المجهر عن خلية ذات نهاية عالقة محددة جيدا. يتم توصيل بعض الخلايا عند طرف واحد فقط ، وتؤدي قوة الانحناء عند الطرف الآخر إلى دوران خلية كاملة بدلا من الانحناء. للعثور على خلية مناسبة ، قم بثني كل خلية بسرعة باستخدام المصيدة باستخدام حركة المسرح التي يتم التحكم فيها بواسطة عصا التحكم.
عندما يتم العثور على خلية مناسبة ، قم بتخفيف محلول الخرزة بمعامل اثنين إلى رطل مع السيفاليكسين ، وأضف 30 ميكرولترا من محلول الخرزة إلى غرفة التدفق عن طريق سحب العينة في أحد طرفيها وتدفقها برفق في الطرف الآخر باستخدام نسيج مسح كيم بصريا ، واحتجاز حبة عائمة ولمسها على الطرف الحر للخلية. اغسل الغرفة مرة أخرى بواسطة micropipet وباستخدام منديل أبيض Kim مع 50 ميكرولتر من السيفاليكسين في LB لإزالة الخرز غير المرفق. بعد ذلك ، قم بتشغيل برنامج عرض مختبر مكتوب مخصص لتطبيق قوى الانحناء على الخلية وتسجيل بيانات الإزاحة القسرية.
أولا ، قم بمعايرة استجابة الكاشف عن طريق مسح RA للحبة المرفقة داخل شعاع ليزر الكشف وتسجيل إشارات جهد 3D PSD. ثم حدد المحور الطويل للخلية في صورة مجهرية. بعد تحديد محور الخلية الطويلة ، حرك الخلية بخطوات في اتجاه عمودي على المحور الطويل أثناء تحريك سجل الخلية ، والمسافة المنقولة وإزاحة الخرزة من مركز المصيدة البصرية.
أخيرا ، قم بتحويل قيم الإزاحة إلى قوة مطبقة باستخدام صلابة المصيدة المقاسة مسبقا وحفظها. إزاحة الطرف والقوة على التقديم هنا هي بيانات الإزاحة القسرية لخلية واحدة. منحدر هذا الخط هو صلابة الانحناء للخلية.
لقد أوضحنا لك للتو كيفية الزواج من صلابة الانحناء من الإشريكية القولونية مع مصيدة بصرية. عند استخدام هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العثور على خلية جيدة ذات نهاية عالقة محددة جيدا ونهاية حرة. هذا كل شيء.
شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
نظرة عامة
يعرض هذا المقال بروتوكولاً لقياس صلابة انحناء الخلايا البكتيرية الخيطية باستخدام تقنيات الاحتجاز البصري. تتضمن الطريقة زراعة خلايا الإشريكية القولونية، وإرفاقها بشريحة غطاء، وتطبيق قوى انحناء لتقييم خصائصها الميكانيكية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء الدقيقة
- الفيزياء الحيوية
- ميكانيكا الخلية
الخلفية
- فهم الخصائص الميكانيكية للخلايا البكتيرية أمر حاسم للحصول على رؤى حول سلوكها وسلامتها.
- يمكن تحفيز النمو الخيطي للإشريكية القولونية لدراسة صلابة انحناءها.
- توفر المصائد البصرية طريقة غير باضعة لتطبيق القوى على الخلايا الفردية.
- ركزت الدراسات السابقة على السلامة الميكانيكية للخلايا في ظروف مختلفة.
غرض الدراسة
- تطوير بروتوكول موثوق لقياس صلابة انحناء خلايا الإشريكية القولونية.
- التحقيق في مساهمات الهياكل داخل الخلوية في ميكانيكا الخلية.
- تعزيز فهم سلوك الخلية البكتيرية تحت الإجهاد الميكانيكي.
الطرق المستخدمة
- زراعة خلايا الإشريكية القولونية في وسط LB إلى المرحلة الأسية.
- تحفيز النمو الخيطي باستخدام السيفاليكسين.
- إرفاق الخلايا بشريحة غطاء معالجة كيميائيًا.
- استخدام المصائد البصرية لتطبيق قوى الانحناء وقياس بيانات الإزاحة.
النتائج الرئيسية
- نجح البروتوكول في قياس صلابة انحناء الخلايا الفردية للإشريكية القولونية.
- تكشف تحليلات البيانات عن العلاقة بين القوة المطبقة وإزاحة الخلية.
- تحديد الخلايا المناسبة للقياس أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج دقيقة.
- تساهم النتائج في فهم ميكانيكا الخلية البكتيرية.
الاستنتاجات
- البروتكول المطور فعال لدراسة الخصائص الميكانيكية للخلايا البكتيرية.
- الاحتجاز البصري أداة قيمة للتحقيق في صلابة الخلية.
- يمكن للدراسات المستقبلية أن تبني على هذه النتائج لاستكشاف جوانب أخرى من ميكانيكا الخلية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Measuring bacterial cell stiffness provides a quantitative readout of structural integrity that can inform target validation in antimicrobial discovery. This biophysical assay enables mechanistic de-risking by linking genetic or chemical perturbations to functional mechanical phenotypes. The method supports early-stage hypothesis testing where changes in bending rigidity reflect alterations in cell wall biosynthesis or cytoskeletal organization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how genetic knockdowns or small molecules affect cell wall integrity.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of compounds that alter mechanical properties as a proxy for lethal target engagement.
- Predictive Value: Stiffness changes serve as early biomarkers of target vulnerability, supporting go/no-go decisions in lead identification.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable force-displacement curves suitable for high-content mechanical phenotyping.
- Reproducibility: Optical trap calibration and linear fitting ensure consistent stiffness measurements across operators and labs.
- Scalability: The method can be adapted to test multiple conditions in parallel using microfluidic flow chambers and automated bead delivery.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with preclinical models where cell wall-targeting antibiotics are evaluated for mechanism of action.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes bacteriostatic from bactericidal effects by correlating stiffness loss with cell lysis.
- Translational Continuity: Enables cross-validation between in vitro mechanical phenotypes and in vivo efficacy in infection models.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, providing orthogonal mechanical data to complement biochemical and growth-based assays.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking mutants or drugs to specific mechanical outcomes, de-risking targets involved in peptidoglycan synthesis.
- Screening: Delivers quantitative outputs (stiffness in pN/µm) that enable rank-ordering of compounds by biophysical impact.
- Analytics: Generates force-displacement datasets requiring linear regression analysis, enabling statistical comparison of mechanical phenotypes across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing a mechanistic basis for predicting how cell wall agents compromise structural integrity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biophysical platform for screening antimicrobial candidates across Gram-negative pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct physical readouts of cell wall integrity upon target perturbation.
- Operational Value: Ensures assay standardization through trap calibration and bead functionalization protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering compounds with non-specific or weak mechanical effects early in screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads demonstrating significant stiffness reduction, correlating with target vulnerability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical trapping, microfluidics, and bacterial culture handling.
- Depends on calibrated laser trapping systems and position-sensitive detectors for force measurement.
- Necessitates standardization of cell attachment, bead coating, and growth conditions across teams.
- Adaptation to other bacterial strains may require optimization of surface chemistry and growth inducers.
- Practical limitations include low throughput due to single-cell manipulation and the need for skilled operators to identify suitable filamentous cells.
