استئصال الكبد المستهدف: إحداث موت خلايا الكبد باستخدام الميترونيدازول في يرقات الزرد المعدلة وراثيا

- قم بإذابة الميترونيدازول في ماء البيض الذي يحتوي على DMSO ، وهو مذيب ، وأضف فينيلثيوريا ، مما يمنع تكوين الصباغ في الأجنة. انقل بعض اليرقات في العمر المناسب إلى لوحات العلاج والتحكم. بعد ذلك ، أضف التركيز المطلوب لمحلول الميترونيدازول إلى لوحة الاختبار وماء البيض الذي يحتوي على DMSO إلى لوحة التحكم.

دع اليرقات في كلتا الصفيحتين تنمو عند 28 درجة مئوية. تنتج اليرقات المعدلة وراثيا النيتروريدكتيز فقط في خلايا الكبد ، مما يحول الميترونيدازول إلى دواء سام للخلايا ، مما يؤدي إلى موت خلايا الكبد المستهدفة فقط. بعد العلاج ، قم بإزالة محلول الميترونيدازول من لوحة المعالجة وغسل الأجنة بماء البيض.

أضف التريكيين لتخدير اليرقات وفحصها تحت مجهر التألق لاستئصال خلايا الكبد الشديدة - تدمير خلايا الكبد. سوف تلاحظ الكبد أصغر بكثير في الأفراد المعالجين من الأفراد في المجموعة الضابطة. في مثال البروتوكول ، سنستخدم الميترونيدازول لاستئصال خلايا الكبد في يرقات الزرد المعدلة وراثيا لدراسة تجديد الكبد.

- انقل ما يصل إلى 100 جنين إلى طبق بتري مقاس 100 ملم يحتوي على 25 مل من ماء البيض وضع الطبق على حرارة 28 درجة مئوية. لمنع التصبغ ، أضف PTU إلى المزرعة لمدة تصل إلى 10 ساعات بعد الإخصاب. بعد 80 ساعة من الإخصاب ، قم بتخدير اليرقات بطبقة التريكيين واستخدم مجهر التألق لجمع يرقات CFP الموجبة ، مع الاحتفاظ فقط بالحيوانات ذات الكبد المتشابه الحجم

ثم استبدل ماء بيض التريكيين بماء البيض العذب المكمل ب PTU وأعد يرقات سمك الزرد الإيجابية CFP إلى حاضنة 28 درجة مئوية. لمعالجة يرقات الزرد باستخدام MTZ ، أولا ، قسم العدد المناسب من اليرقات إلى وعاءين مختلفين للاستزراع. احتفظ بمجموعة اليرقات التجريبية في محلول MTZ المحضر حديثا والمجموعة الضابطة في ماء البيض المكمل ب DMSO.

قم بتغطية المجموعة التجريبية بورق الألمنيوم لمنع تعطيل التصوير الضوئي ل MTZ واحتضان كلتا المجموعتين من يرقات الزرد عند 28 درجة مئوية. في نهاية فترة الاستئصال ، قم بإزالة محلول MTZ من الألواح واغسل الحمم البركانية المعالجة ب MTZ مرتين إلى ثلاث مرات ب 25 مل من ماء البيض واللف ، وتخلص من ماء البيض بعد كل غسلة. بعد الغسيل الأخير ، قم بتثبيت اليرقات بنصف تركيز التريكيين المستخدم سابقا لتجنب وذمة القلب والموت في اليرقات المعالجة ب MTZ. ثم استخدم مرشح CFP على مجهر epifluorescence لتقييم مستويات استئصال خلايا الكبد بناء على حجم الكبد النسبي للحمم البركانية المعالجة MTZ. ضع في اعتبارك أن أسماك الزرد ذات الكبد الكبير التي تمثل 0٪ إلى 5٪ من اليرقات غير مستعصبة ، وتلك ذات الكبد متوسط الحجم تمثل 10٪ إلى 20٪ من اليرقات التي سيتم استئصالها جزئيا ، وتلك التي تحتوي على كبد صغير جدا تمثل 80٪ إلى 90٪ من اليرقات التي يجب استئصالها بالكامل.