$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- أولا ، قم بإعداد الاغاروز بإضافة E3 وسط ، الذي يزود الكالسيوم للأجنة المتكللة إلى الاغاروز المنصهر. بعد ذلك ، أضف MS222 لتخدير الأجنة. قم بتبريد مزيج الاغاروز إلى 38 درجة مئوية ، بالقرب من التصلب. حدد عددا قليلا من الأجنة المنكسرة التي تعبر عن البروتينات الفلورية ، وانقلها إلى مزيج الاغاروز.
بعد ذلك ، أدخل المكبس بالكامل في الشعيرات الدموية الزجاجية وارسم جنينا واحدا ، مع التأكد من دخوله إلى الرأس أولا. بمجرد أن يصلب الاغاروز ، استخدم شريطا لتثبيت الشعيرات الدموية في وضع مستقيم في دورق يحتوي على وسط E3. يعزز القاع الشعري المفتوح تبادل الغازات لعينة الجنين.
ضع الشعيرات الدموية في حامل عينة المجهر الفلوري للصفائح الخفيفة. يشكل الليزر ورقة ضوئية رقيقة ، مما يسمح لهدف الكشف - الموجود بشكل عمودي على العينة - بالتقاط صورة مقطعية. في بروتوكول المثال ، سنقوم بتركيب أجنة الزرد لتصوير العين النامية.
ابدأ بتحضير الاغاروز. قم بإذابة كمية 1 ملليلتر محضرة من 1٪ من نقطة انصهار منخفضة في وسط E3 عند 70 درجة مئوية. بعد حوالي 15 دقيقة ، انقل 600 ميكرولتر من الاغاروز المنصهر إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر ، وأضف 250 ميكرولتر من وسط E3 ، و 50 ميكرولترا من 0.4٪ MS222 ، و 25 ميكرولترا من محلول مخزون حبة الفلورسنت الدوامة.
ضع الأنبوب في كتلة تسخين عند حوالي 39 درجة مئوية ، للسماح للأغاروز بالاقتراب من نقطة الجلي. بعد ذلك ، ادفع الغطاسات ذات الرؤوس التفلون إلى أسفل الشعيرات الدموية الزجاجية ذات القطر الداخلي 1 ملليمتر. تحضير خمسة من هؤلاء.
الآن ، قم بدوامة خليط الاغاروز لفترة وجيزة ثم انقل خمسة أجنة بكمية قليلة من السائل فيه. ثم أدخل الشعيرات الدموية واستنشق جنينا واحدا ، رأسه أولا.
يجب أن يدخل الرأس قبل الذيل ولا يمكن أن يكون هناك أي فقاعات هواء. ارسم محلولا كافيا بحيث يكون هناك حوالي سنتيمترين من الاغاروز فوق الجنين و 1 سم من الاغاروز تحته.
ارسم جنينا واحدا في كل شعيرات دموية قبل المتابعة. تتطلب هذه الخطوة بعض الممارسة لإتقانها. استعد لذلك باستخدام أجنة غير قيمة.
عندما يتجمد الاغاروز تماما ، قم بتخزين العينات في وسط E3 عن طريق دعم الشعيرات الدموية على جدار دورق بالبلاستيسين ، مع فتح القاع في المحلول. الآن ، قم بتجميع حامل العينة. أولا ، أدخل غلامين بلاستيكيين بالحجم المناسب ضد بعضهما البعض في الساق.
يجب أن تكون الشقوق الموجودة على الأكمام متجهة للخارج. بعد ذلك ، قم بتوصيل برغي المشبك وأدخل الشعيرات الدموية من خلال الحامل ، حتى يصبح شريط اللون الأسود مرئيا على الجانب الآخر. تجنب لمس المكبس.
ثم شد المسمار المشبك. بعد ذلك ، ادفع سنتيمترا من الاغاروز من الشعيرات الدموية وقم بقصها. ثم أدخل الجذع في قرص حامل العينة.
قبل تحميل نموذج القرص، تحقق من أن المرحلة في الموضع العلوي في برنامج التحكم. بعد ذلك ، استخدم قضبان التوجيه لتحريك الحامل وأخذ عينة في المجهر. الآن ، قم بتصوير العينة المختارة كما هو موضح في بروتوكول النص.