JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأحياء
0 مشاهدات • 3:27 د • April 30th, 2023
- ابدأ بطبق بتري يحتوي على أجنة في وسط E3. أضف التريكيين لتخدير الأجنة ومحلول فينيلثيوريا ، PTU ، لمنع تكوين الصبغة. بمساعدة مجهر تشريح ، قم بتفكيك الأجنة.
استخدم ماصة زجاجية لنقل أحد الأجنة المتكللة إلى طبق بتري صغير مع قاع زجاجي ضحل جيدا في المنتصف وإزالة الوسط الزائد. بعد ذلك ، ضع محلول الاغاروز بتركيز مثالي لتقليل تشوه الجنين وحركته في أنبوب ميكرو فوج وتسخينه. خفض درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية لتجنب إتلاف الجنين بسبب الحرارة.
صب الطبقة الأولى من الاغاروز فوق الجنين ، واملأ البئر الضحل بالكامل. ضع كوبا آخر فوق البئر وأضف 1٪ agarose فوقه. الطبقة الثانية تثبت زجاج الغطاء في مكانه.
بمجرد أن يصلب الاغاروز ، املأ طبق بتري بوسط E3 الذي يحتوي على التريكيين. هذه هي الطبقة الثالثة وتحافظ على ترطيب الاغاروز والجنين. في البروتوكول التالي ، سنقوم بإجراء تركيب أجار متعدد الطبقات لأجنة أسماك الزرد للتصوير بفاصل زمني طويل.
- قبل التركيب مباشرة ، سخني محلول الاغاروز إلى 65 درجة مئوية ثم اتركيه يبرد إلى حوالي 30 درجة مئوية حتى لا يتضرر الجنين من الحرارة وأضف التريكايين إلى محلول الاغاروز. استخدم أطباق ذات قاع زجاجي مقاس 35 ملم مع قاع زجاجي مغطى برقم صفر. ضع جنينا منزوعا برفق بأحد جوانبه الجانبية باتجاه قاع الطبق باستخدام ماصة زجاجية أو ماصة دقيقة. ثم قم بإزالة أي E3 متبقي بعناية باستخدام ماصة دقيقة.
أضف محلول الاغاروز الأول إلى البئر الصغير الذي تم إنشاؤه بواسطة زجاج الغطاء المتصل بقاع الطبق لتغطية الجنين ، مع التأكد من أن الاغاروز يغطي البئر الصغير ولكنه لا يفيض. قم بتغطية البئر الصغير بزجاج الغطاء لإنشاء مساحة ضيقة مليئة بالأغروز مع الجنين بين كأسي الغطاء. ضع طبقة من محلول الاغاروز بنسبة 1٪ فوق زجاج الغطاء في جميع أنحاء قاع الطبق ، مما يحافظ على زجاج الغطاء في مكانه أثناء تجلبه. ثم املأ الجزء المتبقي من الطبق ب E3 الذي يحتوي على 0.02٪ ثلاثاء للحفاظ على رطوبة النظام. لتحديد تركيز الاغاروز الأمثل للطبقة الأولى ، قم بتركيب الأجنة بتركيزات متزايدة من الاغاروز وقم بإجراء تصوير بفاصل زمني لتحديد التركيز الذي يقلل من تشوه الجنين وحركته ، ثم اختبر نطاقا أدق من التركيزات بناء على النتائج.
- تتمثل الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول في تحديد التركيز الأمثل للأغاروز للطبقة الأولى. اختبر تركيزات النانو المختلفة من الاغاروز مثل 0.030٪ ، 0.032٪ ، وما إلى ذلك ، للعثور على التركيز الأمثل.