تركيب أجار: طريقة أساسية لتركيب أجنة أسماك الزرد الحية للتصوير طويل الأمد

- ابدأ بإضافة E3 متوسط إلى منخفض نقطة انصهار الاغاروز وتسخينه حتى يذوب الاغاروز تماما. يبرد الاغاروز إلى 37 درجة مئوية ويضاف محلول التريكايين. بعد ذلك ، قم بتخدير الأجنة عن طريق إضافة التريكيين إلى طبق بتري يحتوي على أجنة في وسط E3. حرك طبق بتري لجمع الأجنة في المنتصف.

باستخدام ماصة النقل ، ارسم جنينا واحدا بأقل قدر من الوسط. أمسك الماصة في وضع رأسي وارتجد الجنين لوضعه عند طرف الماصة. الآن ضع الجنين في محلول الاغاروز دون إضافة أي وسط زائد ، مما يخفف من الاغاروز ويمنع التبلور. امزج الجنين برفق داخل الاغاروز وانقل المحلول إلى بئر لوحة التصوير باستخدام الماصة.

ضع الصفيحة تحت المجهر واستخدم طرف ماصة لوضع الجنين في الاتجاه المطلوب. بمجرد أن يصلب الاغاروز ، اسكب وسط E3 الذي يحتوي على التريكين فوقه للحفاظ على رطوبة الأجار وتصوير الجنين. في مثال على البروتوكول ، سنقوم بتركيب أجنة الزرد الباربايوتكية للتصوير والتحليل.

للحصول على صور للأجنة المنصهرة ، قم بإعداد 0.8٪ من الاغاروز ذات نقطة الانصهار المنخفضة. بينما لا تزال ساخنة ، قم بتقطيع مليلتر واحد من الاغاروز في أنابيب ميكروفوج سعة 1.5 مليلتر موضوعة في كتلة تسخين 37 درجة مئوية. تخدير الأجنة البارابايتيك عن طريق إضافة 1 مليلتر من 4 ملليغرام لكل مليلتر ، ودرجة الحموضة 7.0 ثلاثية الأبعاد إلى 25 ملليلترا من وسط E3 الذي يحتوي على الأجنة. قم بتدوير الطبق برفق حتى تتجمع الأجنة في المنتصف.

ثم باستخدام ماصة نقل بلاستيكية عريضة الرؤوس ، اسحب الأجنة في أقل قدر ممكن من السائل. بعد ذلك ، أدر الماصة في وضع مستقيم وقم بترتد الأجنة برفق حتى تستقر في قاع الماصة. ثم انقل الأجنة إلى 1 مليلتر من نقطة الانصهار المنخفضة الاغاروز عن طريق لمس طرف الماصة برفق على سطح الاغاروز. تخلص من أي سائل زائد من الماصة واستخدم الماصة لخلط الأجنة برفق في الاغاروز.

ثم ، باستخدام الماصة ، انقل الاغاروز والأجنة إلى بئر صفيحة زجاجية ذات ستة آبار. تحت مجهر استريو ، استخدم طرف تحميل الجل المثبت في نهاية إبرة الإثارة لوضع الأجنة بالقرب من زجاج الغطاء وفي الاتجاه المطلوب للتصوير. بعد أن يتماسك الاغاروز ويضاف الوسط مع التريكيين إلى الآبار ، استخدم مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر أو مجهر متحد البؤر للقرص الدوار المقلوب ذو المجال الواسع للحصول على الصور.

للحصول على مجال رؤية جنين كامل ، استخدم 4x ذاتيا. استخدم هدفا 20x لتصوير نسيج معين. قم بمعالجة الصور وفقا لبروتوكول النص.