بضع الأكسونات بالليزر ثنائي الفوتون: طريقة لإصابة المحاور في أجنة أسماك الزرد ومراقبة الانتعاش المحوري

- ضع الأجنة ذات الأهمية في فينيل ثيوريا ، PTU ، محلول Ringer لمنع تكوين الصباغ ، والذي يبدأ بعد 24 ساعة من الإخصاب. هذا يجعل التشريح النامي أكثر وضوحا ، وهو أمر ضروري لهذا الإجراء. نقل جنين مخدر ثلاثي الأبعاد إلى غرفة التصوير. ضع شريحة زجاجية في الأعلى واعرضها تحت المجهر. ركز على المحور العصبي المراد إصابته ، والذي يمكن رؤيته تحت ليزر 488 نانومتر لأنه يعبر عن GFP عبر الوراثة.

التقط صورة مسبقة للموقع. بعد ذلك ، اعرض المحور العصبي باستخدام ليزر 910 نانومتر مما يتسبب في تألق GFP باللون الأحمر. زيادة شدة هذا الليزر لإصابة المنطقة المستهدفة دون التأثير على الأنسجة المحيطة. هذه العملية تسمى بضع المحور. التقط صورة جديدة باستخدام الليزر الأول لتأكيد بضع المحور ، والذي يظهر على شكل حطام متناثر. في البروتوكول التالي ، سنقوم بإجراء بضع محاور محسية للمحاور الحسية المحيطية في أجنة الزرد باستخدام ليزر ثنائي الفوتون.

- إذا لم يكن منظار الفوتون المخصص متاحا في مختبرك ، فيمكن أيضا استخدام مجهر Zeiss 510 ثنائي الفوتون ثنائي البؤر لقطع المحاور. نبدأ بوضع الجنين المركب على المسرح والتركيز عليه باستخدام هدف مائي 25x. بعد ذلك ، قم بتشغيل ليزر الفوتون والأرجون في إعداد متعدد المسارات بحيث يمكن التبديل من واحد إلى آخر.

على الرغم من استخدام كلا الليزرن للكشف عن GFP ، إلا أن انبعاث الفوتونين يتم تصورهما باللون الأحمر وانبعاث ليزر الأرجون باللون الأخضر من أجل التمييز بين الاثنين. استخدم ليزر الأرجون لتحديد محور عصبي لإصابته. ضمن إعدادات Z ، حدد القسمين البصري الأول والأخير ، والتقط صورة متحدة البؤر ، وقم بإنشاء أقصى عرض لمكدس Z.

قم بإيقاف تشغيل ليزر الأرجون وقم بتشغيل ليزر الفوتونين. امسح بكثافة نقل تبلغ حوالي 9٪ للتأكد من أن المحور العصبي لا يزال في بؤرة التركيز. انقر على إيقاف زر حتى تكون أداة Crop متاحة. استخدم Crop لتكبير منطقة الاهتمام. عادة ما نقوم بالتكبير إلى حوالي 70x. اختر منطقة المحور العصبي المراد إصابته والتركيز على هذه المنطقة. يمكن التحقق من التكبير / التصغير ضمن علامة التبويب الوضع.

بعد ذلك ، ضمن علامة التبويب القنوات ، قم بتغيير شدة الفوتونين من حوالي 9٪ إرسال إلى 15٪ إلى 30٪. لتنشيط الإعدادات الجديدة ، انقر فوق الزر Fast XY ثم انقر فوق إيقاف بسرعة بعد ذلك لتجنب التلف الزائد. يجب أن ينظر إلى المحور العصبي على أنه حطام متناثر إذا نجح الإجراء. أخيرا ، للتأكد من تلف المحور العصبي بالفعل ، عد إلى ليزر الأرجون 488 نانومتر. التقط صورة متحدة البؤر أخرى وقم بإنشاء أقصى عرض لمكدسات Z.