الحقن المجهري للأجنة: تقنية لتوصيل مركب إلى صفار الزرد

- ضع سمكتين من الإناث واثنين من الذكور في حوض تربية مقسم قبل ليلة واحدة من الحقن. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة الحاجز واترك السمك يتكاثر حتى تلاحظ البيض في قاع الخزان. اجمع البيض واغسله بوسط E3 يحتوي على الميثيلين الأزرق ، وهو مبيد للفطريات. راقب البويضات تحت المجهر وقم بإزالة البويضات غير المخصبة. يحتوي البيض غير المخصب على غشاء صفار واضح ، بينما يحتوي البيض المخصب على غشاء صفار داكن.

احتفظ ب 10 أجنة في طبق بتري منفصل كعناصر تحكم غير محقونة. باستخدام ماصة النقل، قم بمحاذاة الأجنة في حوض لوحة الحقن المجهري في درجة حرارة الغرفة وضعها تحت المجهر. ادفع إبرة الحقن المجهري برفق من خلال المشيمة في صفار البيض وقم بحقن مركب مهم ببطء يحتوي على علامة مثل الفينول الأحمر. يسمح التدفق السيتوبلازمي للمركب بالانتشار في الخلايا الجنينية.

بعد الحقن ، قم بزراعة الأجنة في وسط E3 مع الميثيلين الأزرق عند 28 درجة مئوية. استمر في التحقق من صحة الأجنة. قم بإزالة أي أجنة ميتة أو ناتجة بشكل غير طبيعي وقم بتغيير الوسط يوميا. في البروتوكول التالي ، سنستخدم الحقن المجهري لتوصيل بروتين نووي الريبي ، أو مركب RNP ، إلى أجنة الزرد.

- أولا ، قم بإعداد الأشخاص الذين يستخدمون أسماك الزرد للتكاثر في الليلة السابقة لإجراء الحقن كما هو موضح في البروتوكول النصي. ثم امزج بين بروتين Cas9 و sgRNA بنسبة اثنين إلى واحد. احتضان المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق بينما يشكل Cas9 و sgRNA مركبا من البروتين النووي الريبي. ثم أضف 0.5 ميكرولتر من محاليل الفينول الحمراء بنسبة 2.5٪ في ماء خال من RNase كاف لتحقيق حجم نهائي يبلغ خمسة ميكرولترات.

لتحضير إبرة الحقن، استخدم مجتذب ماصة دقيقة لسحب شعيرات دموية زجاجية بحجم ملليمتر واحد. ثم قم بقص طرف الإبرة الزجاجية الناتجة بشفرة حلاقة للحصول على فتحة بزاوية. ضع الإبرة في جهاز معالج دقيق متصل بحاقن دقيق. باستخدام مجهر ضوئي ، اضبط ضغط الحقن حتى تقوم الإبرة بحقن نانولتر واحد من المحلول باستمرار في طبق بتري.

- قبل إجراء الحقن المجهري للأجنة ، تدرب على تحضير الإبر وحقن أجنة التحكم باستخدام محلول صبغي فقط وسجل البقاء على قيد الحياة بعد 24 ساعة من النمو. يجب أن تكون قادرا على الحصول على بقاء أكثر من 90٪ مقارنة بعنصر تحكم غير محقون.

- بعد ذلك ، حدد 10 إلى 15 جنينا كمجموعة تحكم وضعها في طبق بتري منفصل يحمل علامة تجارية. باستخدام ماصة النقل ، قم بتبطين الأجنة المتبقية بحذر على لوحة حقن بدرجة حرارة الغرفة. تحت مجهر التشريح ، قم بحقن نانولتر واحد من المحلول في كيس صفار البيض في كل جنين. ثم أعد الأجنة المحقونة إلى طبق بتري المسمى وقم بتغطيتها بوسائط 1X E3 باللون الأزرق الميثيلين. ضع الأجنة المحقونة في حاضنة على حرارة 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. ثم افحص الأجنة المحقونة لإزالة الأفراد الموتى أو الذين يتطورون بشكل غير طبيعي.