إعداد أنسجة المخ فأرة للالميكروسكوب Immunoelectron

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير أنسجة دماغ الفأر للمجهر الإلكتروني المناعي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تثبيت الدماغ من خلال تروية الحيوان. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تقطيع الدماغ ومعالجة المقاطع لإجراء الكيمياء النسيجية المناعية.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تثبيت المقاطع وتجفيفها وتضمينها. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي قطع مقاطع فائقة الرقة. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر بدقة مكانية عالية توزيع البروتينات المختلفة ضمن المناطق وأنواع الخلايا المختلفة في الجهاز العصبي المركزي.

مرحباً، أنا ماريا ترومبلي من مختبر إسكا في قسم البيولوجيا العصبية والتشريح بجامعة روتشستر. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحضير أنسجة دماغ الفأر للفحص بالمجهر الإلكتروني المناعي. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التفاعلات بين الخلايا الدبقية الصغيرة والمشابك العصبية أثناء النمو، واللدونة المعتمدة على الخبرة، والشيخوخة.

فلنبدأ الآن. بعد تثبيت دماغ الفأر عن طريق التروية القلبية، قم بتثبيته لاحقاً في حوالي 10 milliliters من الفورمالديهايد عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعتين. اغسل الدماغ في محلول 1X PBS عند درجة حرارة 4 °C ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل غسلة باستخدام جهاز هزاز ومحلول 1X PBS مبرد بالثلج، ثم قم فوراً بتقطيع الدماغ إلى مقاطع عرضية بسماكة 50 micron.

استخدم فرشاة دقيقة لنقل المقاطع المختارة إلى قارورة زجاجية مملوءة بـ 1X PBS عند درجة حرارة 4 °C. تُحفظ المقاطع المتبقية في مادة واقية من التجمد عند درجة حرارة -20 °C لمدة تصل إلى عدة سنوات دون أن تتغير. يتم معالجة 10 مقاطع كحد أقصى من المقاطع الطافية بحرية للتصبيغ في كل قارورة زجاجية.

استخدم ماصة نقل لاستبدال محلول 1X PBS بمحلول 0.1% Sodium borohydride في PBS، مع تغيير المحاليل بسرعة لتجنب جفاف المقاطع. يتم التحضين لمدة 30 دقيقة، ثم تُشطف المقاطع بمحلول 1X PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة. مع الحرص على إزالة جميع الفقاعات، ثم يتم النقل إلى محلول 1X PBS يحتوي على 0.5% gelatin و 5% normal serum المناسب للأجسام المضادة الثانوية التي سيتم استخدامها.

يُحضن لمدة ساعتين. يُضاف الجسم المضاد الأولي المُخفف في محلول الحجب. يُحضن لمدة 48 ساعة.

يُشطف باستخدام 1X PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق. ثم يُحضن كل منها مع جسم مضاد ثانوي مقترن بالبيوتين ومخفف في محلول الحجب لمدة ساعتين. يُشطف ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في 1X PBS كما سبق.

قم بالتحضين باستخدام streptavidin horseradish peroxidase المخفف في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة. اشطف المقاطع مرة واحدة في one XPBS ومرتين في one XTBS لمدة 10 دقائق لكل منها. لإظهار الوسم، قم بتحضين المقاطع مع محلول مُحضّر حديثاً يحتوي على 0.05%dab و 0.01%hydrogen peroxide في one XTBS.

عندما يصبح التلوين بنيًا داكنًا بشكل مرئي أو عند مرور خمس دقائق على التفاعل، تُشطف القطاعات بـ one XTBS لإيقاف التفاعل. ثم تُشطف مرة واحدة بـ one XTBS ومرتين بـ one x PB لمدة 10 دقائق في كل مرة. وفي خزانة استخلاص الغازات، تُستخدم فرشاة دقيقة لنقل القطاعات إلى طبق زراعة متعدد الآبار مملوء بـ one XPB.

قم بإزالة الـ PB من بئر واحد باستخدام فرشاة ناعمة لبسط المقاطع بشكل مسطح على الفور. أضف محلولاً من رابع أكسيد الأوزميوم بتركيز 1% في PB أحادي التركيز قبل الانتقال إلى البئر التالي، ثم حضن المقاطع في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. انقل مقاطع OSM إلى قوارير زجاجية.

اشطف باستخدام XPB لثلاث مرات، لمدة 10 دقائق في كل مرة. قم بتجفيف المقاطع باستخدام تركيزات متزايدة من الإيثانول، ثم استخدم أكسيد البروبيلين كما هو موضح في الجزء النصي من هذا البروتوكول.

استخدم فرشاة دقيقة مغسولة في propylene oxide لنقل المقاطع إلى راتنج dupant تم تحضيره حديثاً. وللتشريب طوال الليل، ضع الطبق الذي يحتوي على المقاطع في فرن عند درجة حرارة 55 °C لمدة 10 دقائق. ولتليين الراتنج، استخدم فرشاة مغسولة بـ propylene oxide لطلاء فيلم تطميس chlor بطبقة رقيقة من الراتنج.

انقل المقطع إلى الفيلم وقم بتغطيته بفيلم تضمين آخر، ثم وزع أوزانًا خفيفة تبلغ حوالي 2 g بالتساوي في الأعلى للمساعدة في انتشار الراتنج. اترك الراتنج ليتبلمر عند 55 °C لمدة تتراوح من 48 إلى 72 ساعة في الحاضنة. بعد عملية البلمرة، قم بإزالة الأوزان من الطبقة العلوية لفيلم التضمين باستخدام مجهر ثنائي العينين.

حدد منطقتين من مناطق الاهتمام بمساحة 2×2 ملم، واستخدم شفرة حلاقة لاستئصالهما من الغشاء. ثبّت مناطق الاهتمام باستخدام الغراء السريع (Super Glue) على أطراف قوالب الراتنج. ثم قم بعملية المعالجة في حاضنة بدرجة حرارة 55 °C لمدة ساعة واحدة.

استخدم شفرة حلاقة لقص كتلة الراتنج لتصبح على شكل شبه منحرف متساوي الساقين، وهو الشكل الأمثل لعملية الشفط فائقة الرقة. وباستخدام الميكروتوم وسكين زجاجي، قم بإزالة الغراء الموجود على سطح النسيج للحصول على سطح مستوٍ، وذلك تمهيداً لعملية الشفط.

املأ حوض السكين الزجاجية بالماء المقطر مرتين، ثم اقطع بضع مقاطع يتراوح سمكها بين 0.5 و1 ميكرون. استخدم حلقة نقل (Perfect Loop) لنقل المقاطع إلى شريحة زجاجية فائقة التجميد (Super Frost slide). جفف المقاطع على لوح تسخين عند درجة حرارة 80 درجة Celsius لمدة دقيقة واحدة، ثم صبغها بصبغة التولويدين بلو (Toluidine blue) بتركيز 0.1% لمدة دقيقة واحدة.

استخدم زجاجة رش لشطف الصبغة الزائدة باستخدام ماء مقطر مرتين. افحص المقاطع تحت مجهر ضوئي للتمييز بين النسيج المصبوغ والراتنج. قم بقص مقاطع شبه رقيقة حتى يصل الحد الفاصل بين النسيج والراتنج تقريبًا إلى منتصف المقطع. استبدل السكين الزجاجية بسكين ماسية واملأ حامل العينات بالماء المقطر مرتين.

قم بقص العينة الفضية إلى شرائح فائقة الرقة. اجعل سمك المقاطع يتراوح بين 60 إلى 80 nanometers. استخدم ملاقط دقيقة مقلوبة لجمع المقاطع بعناية على شبكات نحاسية.

جفف الشبكات على ورق ترشيح لتعزيز التباين. استخدم ملاقط مقلوبة دقيقة لنقل الشبكة إلى قطرة من سترات الرصاص لمدة دقيقتين. اشطف الشبكة بعناية عن طريق غمرها في ثلاثة حمامات متتالية من الماء المقطر مرتين.

جفف الشبكة على ورق ترشيح ثم احفظها في صندوق الشبكات لفحصها لاحقاً بواسطة المجهر الإلكتروني. افحص الشبكات تحت المجهر الإلكتروني لتصور الصبغ المناعي، وكذلك مورفولوجيا العناصر الخلوية، والعضيات داخل الخلوية وعلاقاتها ببعضها البعض.

يظهر هنا صبغ مناعي ممثل لـ IBA one على مستوى المجهر الضوئي. يقتصر التوزيع الخلوي لـ IBA one على الخلايا الدبقية الصغيرة، مما يؤكد خصوصيته على مستوى المجهر الإلكتروني. وتظهر هنا أجسام الزوائد الخلوية للخلايا الدبقية الصغيرة المصبوغة مناعياً بـ IBA one.

يظهر صبغ DAB المناعي البيروكسيدازي على شكل راسب كثيف إلكترونيًا. وفي أمثلة أخرى لـ IBA one، تظهر استطالات الخلايا الدبقية الصغيرة المصبوغة مناعيًا بأحجام وأشكال مختلفة. ويكشف التكبير العالي عن وجود عضيات خلوية متنوعة داخل إحدى استطالات الخلايا الدبقية الصغيرة، وكذلك العلاقات البنيوية الدقيقة بين استطالة أخرى للخلايا الدبقية الصغيرة والعناصر المجاورة في النسيج العصبي، بما في ذلك التشابكات العصبية.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحضير أنسجة دماغ الفأر للمجهر الإلكتروني المناعي. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر اتباع جميع الخطوات بدقة والتعامل مع أنسجة الدماغ برفق. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.