إعداد أنسجة المخ فأرة للالميكروسكوب Immunoelectron

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير أنسجة دماغ الفأر للفحص بالمجهر الإلكتروني المناعي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تثبيت الدماغ عبر التروية الحيوانية. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تقطيع الدماغ ومعالجة المقاطع لإجراء الكيمياء النسيجية المناعية.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تثبيت المقاطع وتجفيفها وتضمينها. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي قطع مقاطع فائقة الرقة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر، بدقة مكانية عالية، توزيع البروتينات المختلفة داخل المناطق وأنواع الخلايا المختلفة في الجهاز العصبي المركزي.

مرحباً، أنا ماريا ترومبلي من مختبر إسكا في قسم البيولوجيا العصبية والتشريح بجامعة روتشستر. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحضير أنسجة دماغ الفأر من أجل المجهر الإلكتروني المناعي. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التفاعلات بين الخلايا الدبقية الصغيرة والمشابك العصبية أثناء التطور، واللدونة المعتمدة على الخبرة، والشيخوخة.

لنبدأ الآن. بعد تثبيت دماغ الفأر عن طريق التروية القلبية، قم بالتثبيت اللاحق في 10 ملليلتر تقريباً من الفورمالديهايد عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعتين. اغسل الدماغ في محلول 1 XPBS عند درجة حرارة 4 °C ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل غسلة باستخدام جهاز هزاز ومحلول 1 XPBS مبرد بالثلج، ثم قم بتقطيع الدماغ فوراً إلى مقاطع عرضية بسمك 50 ميكرون.

استخدم فرشاة دقيقة لنقل المقاطع المختارة إلى قارورة زجاجية مملوءة بـ 1× PBS عند درجة حرارة 4 °C. تُحفظ المقاطع المتبقية في مادة واقية من التجميد (Cryoprotectant) عند درجة حرارة -20 °C لمدة تصل إلى عدة سنوات دون تغيير. يتم معالجة 10 مقاطع كحد أقصى من المقاطع الطافية بحرية للتصبيغ في كل قارورة زجاجية.

استخدم ماصة نقل لاستبدال محلول XPBS بـ 0.1% Sodium borohydride طازج في PBS، مع تغيير المحاليل بسرعة لتجنب جفاف المقاطع. يتم التحضين لمدة 30 دقيقة، ثم تُشطف المقاطع باستخدام XPBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة، مع الحرص على إزالة جميع فقاعات الهواء، ثم تُنقل إلى XPBS يحتوي على 0.5% gelatin و 5% normal serum مناسب للأجسام المضادة الثانوية التي سيتم استخدامها.

يُحضن المزيج لمدة ساعتين. ثم يُضاف الجسم المضاد الأولي المخفف في محلول الحجب. يُحضن المزيج لمدة 48 ساعة.

اشطف باستخدام XPBS مرة واحدة لمدة 10 دقائق لثلاث مرات. يتم تحضين كل عينة مع جسم مضاد ثانوي مقترن بالبيوتين ومخفف في محلول الحجب لمدة ساعتين. اشطف ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في XPBS مرة واحدة كما سبق.

يتم التحضين مع streptavidin horseradish peroxidase المخفف في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة. تُشطف المقاطع مرة واحدة في one XPBS ومرتين في one XTBS لمدة 10 دقائق في كل مرة. ولإظهار الوسم، تُحضن المقاطع مع محلول محضر حديثاً يحتوي على 0.05%dab و 0.01%hydrogen peroxide في one XTBS.

عندما يصبح التلوين بنيًا داكنًا بشكل مرئي أو عند مرور خمس دقائق على التفاعل، اشطف المقاطع باستخدام XTBS بتركيز 1 لإيقاف التفاعل. بعد ذلك، اشطف مرة واحدة باستخدام XTBS بتركيز 1 ومرتين باستخدام PB بتركيز 1x لمدة 10 دقائق في كل مرة. وباستخدام خزانة استرداد الأدخنة، استخدم فرشاة دقيقة لنقل المقاطع إلى طبق زراعة متعدد الفجوات مملوء بـ XPB بتركيز 1.

قم بإزالة محلول PB من إحدى الفجوات باستخدام فرشاة ناعمة لفرد المقاطع بشكل مسطح فوراً. أضف محلولاً من 1% osmium tetroxide في one x PB قبل الانتقال إلى الفجوة التالية، ثم قم بالتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. انقل مقاطع OSM إلى قوارير زجاجية.

اشطف باستخدام XPB واحد لمدة ثلاث مرات، في كل مرة لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الماء من المقاطع باستخدام تركيزات متزايدة من الإيثانول. ثم استخدم أكسيد البروبيلين كما هو موضح في الجزء النصي من هذا البروتوكول.

استخدم فرشاة دقيقة مغسولة في propylene oxide لنقل المقاطع إلى راتنج dupant المُحضّر حديثاً. وللتشريب طوال الليل، ضع الطبق الذي يحتوي على المقاطع في فرن بدرجة حرارة 55 °C لمدة 10 دقائق. ولتليين الراتنج، استخدم فرشاة مغسولة بـ propylene oxide لطلاء غشاء chlor embedding بطبقة رقيقة من الراتنج.

انقل المقطع إلى الفيلم وغطه بفيلم تثبيت آخر. وزع أثقالاً خفيفة تزن حوالي 2 جرام بالتساوي على السطح للمساعدة في نشر الراتنج. اترك الراتنج ليتبلمر عند درجة حرارة 55 °C لمدة تتراوح بين 48 إلى 72 ساعة في الحاضنة. بعد البلمرة، قم بإزالة الأثقال من الطبقة العلوية لفيلم التثبيت باستخدام مجهر ثنائي العينين.

حدد مناطق اهتمام تبلغ مساحتها 2×2 مليمتر واستخدم شفرة حلاقة لاستئصالها من الفيلم. قم بلصق مناطق الاهتمام على أطراف كتل راتنجية باستخدام الغراء السريع (Super Glue). يتم الإنضاج في حاضنة عند درجة حرارة 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

استخدم شفرة حلاقة لقص كتلة الراتنج لتصبح على شكل شبه منحرف متساوي الساقين، وهو الشكل الأمثل لعملية الشفط فائقة الرقة. وباستخدام الميكروتوم وسكين زجاجية، قم بإزالة الغراء الموجود على سطح النسيج للحصول على سطح مستوٍ، وذلك تمهيداً لعملية الشفط.

املأ حمام السكين الزجاجية بالماء المقطر مرتين، وقم بقطع بضع مقاطع تتراوح سماكتها بين 0.5 و1 ميكرون. استخدم حلقة نقل دقيقة لنقل المقاطع إلى شريحة ذات خاصية الالتصاق الفائق (super frost). جفف المقاطع على لوح تسخين بدرجة حرارة 80 درجة Celsius لمدة دقيقة واحدة، ثم صبغها بصبغة toluidine blue بتركيز 0.1% لمدة دقيقة واحدة.

استخدم زجاجة رش لشطف الصبغة الزائدة باستخدام ماء مقطر مزدوج. تحت مجهر ضوئي، افحص المقاطع لتمييز النسيج المصبوغ عن الراتنج. قم بقطع مقاطع شبه رقيقة حتى يصل الحد الفاصل بين النسيج والراتنج تقريباً إلى منتصف المقطع. استبدل السكين الزجاجية بسكين ماسية واملأ الحامل بالماء المقطر المزدوج.

قم بقطع الفضة إلى شرائح فائقة الرقة. اجعل سمك المقاطع من 60 إلى 80 nanometers. استخدم ملاقط دقيقة مقلوبة لجمع المقاطع بعناية على شبكات نحاسية.

جفف الشبكات على ورق ترشيح لتعزيز التباين. استخدم ملاقط مقلوبة دقيقة لنقل الشبكة إلى قطرة من سترات الرصاص لمدة دقيقتين. اشطف الشبكة برفق عن طريق غمرها في ثلاثة حمامات متتالية من الماء المقطر مرتين.

جفف الشبكة على ورق ترشيح ثم احفظها في صندوق الشبكات لفحصها لاحقاً بواسطة المجهر الإلكتروني. افحص الشبكات باستخدام المجهر الإلكتروني لمعاينة الصبغ المناعي، وكذلك شكل العناصر الخلوية، والعضيات داخل الخلوية وعلاقاتها ببعضها البعض.

يظهر هنا صبغ مناعي تمثيلي لـ IBA one عند مستوى المجهر الضوئي. يقتصر التوزيع الخلوي لـ IBA one على الخلايا الدبقية الصغيرة، مما يؤكد نوعيته عند مستوى المجهر الإلكتروني. تظهر أجسام واستطالات الخلايا الدبقية الصغيرة المصبوغة مناعياً بـ IBA one.

يظهر صبغ DAB بالبيروكسيداز المناعي على هيئة راسب كثيف الإلكترونات. وفي أمثلة أخرى لـ IBA one، تظهر الاستطالات الميكروغليالية المصبوغة مناعياً بأحجام وأشكال مختلفة. ويكشف التكبير الأعلى عن وجود عضيات خلوية متنوعة داخل إحدى الاستطالات الميكروغليالية، وكذلك العلاقات البنيوية الدقيقة بين استطالة ميكروغليالية أخرى وعناصر النسيج العصبي المجاورة، بما في ذلك المشابك العصبية.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحضير أنسجة دماغ الفأر من أجل المجهر الإلكتروني المناعي. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر اتباع جميع الخطوات بدقة والتعامل مع أنسجة الدماغ برفق. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.