JoVE Encyclopedia of Experiments
أبحاث السرطان
0 مشاهدات • 3:19 د • April 30th, 2023
الفيروس العدسي هو فيروس قهقري يحتوي على مادة وراثية للحمض النووي الريبي. يوفر هذا الفيروس طريقة فعالة ومستقرة لإدخال الجينات المعدلة وراثيا إلى خطوط الخلايا السرطانية. ابدأ بإضافة النيورامينيداز إلى أنبوب يحتوي على فيروس العدسات الذي يعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر ، أو GFP. احتفظ بالأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لزيادة كفاءة ربط الفيروس.
بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي أنبوبا يحتوي على تعليق الخلايا السرطانية لتشكيل حبيبات. أضف وسائط الماموسفير التي تحتوي على البوليبرين لإعادة تعليق الخلايا. البوليبرين هو بوليمر كاتيوني يزيد من كفاءة العدوى الفيروسية. الآن قم بوضع العدد الأمثل من الخلايا السرطانية لكل بئر في لوحة ثقافة أنسجة بستة آبار. أضف الكمية المطلوبة من Lentivirus إلى كل بئر من لوحة الاستزراع.
قم بتدوير الطبق لخلط المحتوى ، واحتفظ به عند 37 درجة مئوية لمدة 96 ساعة مع إمداد مستمر بثاني أكسيد الكربون. يدخل فيروس العدسات الخلية ويطلق الحمض النووي الريبي. يحول النسخ العكسي الفيروسي الحمض النووي الريبي إلى حمض نووي مزدوج تقطعت به السبل يندمج في جينوم المضيف. ضع اللوحة تحت مجهر الفلورسنت وراقب الخلايا لنقل ناجح. تتألق الخلايا المنقولة بسبب تعبير GFP.
في مثال البروتوكول ، سنقوم بنقل الخلايا السرطانية المنفصلة PDX مع نواقل الفيروسات العدسية.
لتحويل الخلايا السرطانية ، قم بالطرد المركزي للخلايا المعزولة لإعادة التعليق في ملليلترين من وسط الماموسفير بعد العد ، قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى وأعد تعليق الحبيبات في ملليلترين من وسط الماموسفير ، مع استكمال 20 ميكرولتر من البوليبرين. بعد ذلك ، لوحة 2 في 10 إلى الخلايا السرطانية الخامسة القابلة للحياة لكل بئر في لوحة ثقافة أنسجة جيدة الالتزام منخفض للغاية وجزيئات العدسات الفيروسية للخلايا في تعدد العدوى 10.
قمبتدوير اللوحة لخلط الفيروس مع الخلايا واحتضان المزارع المشتركة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة تصل إلى 96 ساعة ، مع إضافة 500 ميكرولتر من وسط الماموسفير الطازج بعد أول 24 ساعة. عندما تكون 10٪ على الأقل من الخلايا إيجابية GFP ، انقل الخلايا المنقولة من بئر واحد على الأقل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر على الجليد واغسل البئر بمليلتر واحد من وسط الماموسفير
قم بتجميع الغسيل مع الخلايا وقم بالطرد المركزي للخلايا السرطانية في 10 ملليلتر من HBSS بالإضافة إلى HEPES. أخيرا ، أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولترا من مستخلص المصفوفة السفلية على الجليد وقم بتحميل الخلايا المدمجة في حقنة أنسولين سعة 0.5 ملليلتر لإعادة الزرع.