مقايسة تكوين مستعمرة أجار الناعمة: طريقة لاختبار تأثيرات المركبات الجديدة على تكاثر الخلايا السرطانية

للبدء ، خذ تركيزا مناسبا من الاغاروز المنصهر في أنبوب مخروطي الشكل وأضف الكمية المرغوبة من وسط الثقافة الدافئة إليه. اقلبها برفق لخلط المحتويات. أضف هذا الخليط إلى كل بئر من ستة آبار ، واتركه يتصلب. هذه هي الطبقة السفلية. بعد ذلك ، عالج الخلايا السرطانية بالمركب محل الاهتمام وأضف التركيز المطلوب من الاغاروز.

الآن ، صب هذا الخليط الذي يحتوي على العدد المطلوب من الخلايا لكل مليلتر في كل بئر. هذه طبقة تحتوي على خلية. بمجرد أن يصلب الوسط ، احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة أسبوع. قم بإعداد طبقة مغذية عن طريق خلط الاغاروز إلى الوسط واستكمال هذا الخليط بمركب الاهتمام. أضف طبقة التغذية هذه برفق في كل بئر ، واتركها تتصلب ، واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية.

كرر إجراء التغذية هذا أسبوعيا لتجديد الخلايا بالوسط حتى تتشكل المستعمرات. إذا كان المركب محل الاهتمام مثبطا للورم ، فسوف يثبط نمو الخلايا مما يؤدي إلى عدد قليل من المستعمرات في الآبار. في البروتوكول التالي ، سنقوم بإجراء اختبار تكوين مستعمرة أجار ناعمة لدراسة تأثير مثبطات PADI على أورام خلايا سرطان الثدي.

ابدأ هذا الإجراء بتحضير 3٪ 2-hydroxyethyl agarose. في زجاجة زجاجية نظيفة وجافة سعة 100 مل ، أضف 0.9 جرام من 2-هيدروكسي إيثيل أغاروز متبوعا ب 30 مل من الماء المقطر. يسكب المزيج في الميكروويف لمدة 15 ثانية ويحرك برفق. كرر هذه الخطوة حتى يذوب مسحوق الاغاروز تماما. بعد ذلك ، قم بالتعقيم بالمحلول الذي يحتوي على زجاجة لمدة 15 دقيقة.

اترك محلول الاغاروز يبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام مرة أخرى. قم بتسخين عدة ماصات سعة خمسة ملليلتر و10 ملليلتر مسبقا في حاضنة 37 درجة مئوية لمنع الاغاروز من التصلب في الماصة عند المناولة. قم بفك غطاء الزجاجة جزئيا وقم بتسخين محلول 3٪ 2-hydroxyethyl agarose المصنوع مسبقا بنسبة 3٪ لمدة 15 ثانية. ثم حرك المحلول برفق والميكروويف لمدة 15 ثانية أخرى.

كن حذرا عند تحريك محلول الاغاروز لأن المحلول يرتفع عند تعرضه للهواء ويمكن أن ينسبت. إذا كان هناك هلام صلب متبقي في الزجاجة ، فاستخدمه في الميكروويف لبضع ثوان أخرى. احتفظ بالزجاجة التي تحتوي على محلول الاغاروز في حمام مائي بدرجة حرارة 45 درجة مئوية خلال الخطوات التالية لمنع محلول الاغاروز من التصلب قبل الأوان.

بعد ذلك ، انقل 12 مل من الوسائط الدافئة باستخدام الماصات الدافئة مسبقا إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. أضف على الفور ثلاثة ملليلتر من محلول الاغاروز 3٪ واقلب الأنبوب المخروطي برفق لخلط الاغاروز مع الوسائط. ثم أضف ملليلترين من هذا الخليط برفق في كل بئر من صفيحة ثقافة مكونة من ستة آبار دون تكوين أي فقاعات هواء. احتضان صفيحة الاستزراع المكونة من ستة آبار أفقيا على سطح مستو عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح للخليط بالتصلب.

بعد أن يتماسك الخليط ، ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الطبقة السفلية جاهزة الآن للاستخدام.

يتمثل أحد الجوانب الصعبة في هذا الإجراء في التأكد من توزيع جميع الخلايا بالتساوي وأن هلام الاغاروز المذاب لا يتجمد قبل إضافته إلى كل بئر ، لضمان خلط الخلايا في الوسائط قبل إضافة هلام الاغاروز السائل. بالإضافة إلى ذلك، يتم تسخين الماصات مسبقا لتجنب تصلب المحاليل أثناء المناولة.

لتحضير الخلية التي تحتوي على طبقة ، قم أولا بتربسين الخلايا MCF10DCIS وتخفيفها إلى تركيز خلية يبلغ 40,000 خلية لكل مليلتر. ثم خذ ثمانية ملليلتر من الوسائط باستخدام ماصات مسخنة مسبقا ، وانقلها إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. أضف على الفور ملليلترين من 3٪ agarose إلى الأنبوب المخروطي ، واقلبها برفق لخلط الاغاروز مع الوسائط. تجنب تكوين أي فقاعات.

بعد ذلك ، خذ ملليلترين من الخلايا وعالجها باثنين من ميكرومولار BB-chlor-amidine في DMSO ، أو DMSO وحده كعنصر تحكم. بعد العلاج ، قم بخلط الخلايا مع 0.6٪ agarose في تخفيف واحد إلى واحد لعمل تركيز نهائي من ميكرومولار BB-chlor-amidine. ثم خذ ملليلترا واحدا من خليط الخلية والأغاروز وأضفه برفق إلى الطبقة السفلية من لوحة الثقافة المكونة من ستة آبار.

ضع لوحة الاستزراع المكونة من ستة آبار أفقيا على سطح مستو عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح للطبقة العليا بالتصلب. بعد أن يتماسك الخليط ، ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة أسبوع قبل إضافة طبقة التغذية. ابدأ في تحضير طبقة التغذية عن طريق وضع محلول 3٪ 2-hydroxyethyl agarose المصنوع مسبقا كما كان من قبل ، وموازنة زجاجة محلول الاغاروز في حمام مائي 45 درجة مئوية.

امزج ملليلترا واحدا من محلول الاغاروز بنسبة 3٪ مع تسعة ملليلتر من الوسائط الدافئة في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، واقلبها برفق لخلط الاغاروز مع الوسائط. تجنب تكوين فقاعات الهواء. بعد معالجة الخليط ب BB-chlor-amidine ، أضف ملليلترا واحدا من الخليط برفق في كل بئر من صفيحة الثقافة المكونة من ستة آبار تحتوي على الطبقات السفلية والناعمة. ثم ضع صفيحة الاستزراع المكونة من ستة آبار أفقيا على سطح مستو عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح للخليط بالتصلب.

بعد أن تصلب طبقة التغذية ، ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية. كرر إجراء التغذية هذا أسبوعيا عن طريق تراكب مليلتر واحد من محلول المعالجة المتوسطة الاغاروز بنسبة 0.3٪ على طبقة التغذية الحالية لتجديد الخلايا بوسائط جديدة حتى يتم ملاحظة تكوين المستعمرة.