تحضير عينة لعمليات التمثيل الغذائي: طريقة لتحضير عينات الخلايا للتنميط المستقلب

التمثيل الغذائي هو دراسة لتحديد وتحديد المستقلبات الموجودة داخل الخلايا. لتحضير العينة ، ابدأ بزرع خلايا سرطان الثدي جنبا إلى جنب مع وسط النمو في طبقين يحملان اسم الاختبار والتحكم. احتضان لمدة ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية. الآن ، قم بإزالة الوسط وأضف وسطا جديدا مع الاستراديول في لوحة الاختبار والوسط العادي في لوحة التحكم.

يرتبط الاستراديول بمستقبلات هرمون الاستروجين ألفا في خلايا سرطان الثدي للحث على تعبيرات معينة ، مما يتسبب في تغيير في تكوين المستقلب. احتضان اللوحات للمدة المطلوبة. استبدل الوسط بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج البارد أو PBS لغسل الخلايا ثم أضف الأسيتون المثلج. توقف الكواشف الباردة المثلجة عمل البروتياز وبالتالي تمنع تدهور البروتين.

استخدم الآن مكشطة لفصل الخلايا عن الألواح ، ونقلها إلى أنابيب بمساعدة ماصة. خذ 20 ميكرولترا من معلق الخلية هذا على مقياس كثافة الدم واحسب عدد الخلايا. قم بتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى يتم استخدامها لمزيد من التحليل. في البروتوكول التالي ، نقوم بإعداد عينات من خلايا MCF-7 لكروماتوغرافيا الغاز وقياس الطيف الكتلي.

باستخدام خلايا MCF-7 المزروعة وفقا لبروتوكول النص ، أضف خمسة ملليلتر من الثلج البارد 1x PBS إلى اللوحة. ثم قم بإمالة اللوحة عدة مرات قبل إزالة PBS. كرر ذلك مرتين أخريين ، وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBS بعد الغسيل الأخير. أضف 750 ميكرولترا من الأسيتون المبرد مسبقا إلى كل صفيحة واكشط الخلايا ، ثم اجمع الخلايا من لوحين في أنبوب ملليلتر على الجليد.

لحساب الخلايا للتطبيع ، لكل علاج ، استخدم لوحين إضافيين لقياس كمية الخلية. ثم لفصل الخلايا عن الألواح ، أضف 2 مل من عازلة HE واحتضانها لمدة خمس دقائق. امزج الخلايا جيدا عن طريق سحب العينة في المخزن المؤقت لكفاءة الهيئة.

ثم استخدم 20 ميكرولترا من محلول الخلية في مقياس كثافة الدم لحساب رقم الخلية تحت المجهر. قم بتخزين العينات عند سالب 80 درجة مئوية قبل استخدام تحليل الطيف الكتلي لكروماتوغرافيا الغاز لتحديد وتحديد المستقلبات. إجراء تحليل تكاملي وفقا لبروتوكول النص.