$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- للبدء ، قم بتخفيف الخلايا السرطانية المعزولة أو الخلايا السرطانية إلى التركيز المطلوب باستخدام محلول مضاد للارتباط يحمي الخلايا من قص السوائل وتلف الضغط. بعد ذلك ، قم بتجميع شريحة مجهر مطلية بالبولي يسين وبطاقة مرشح الطرد المركزي الخلوي في مجموعة قمع الطرد المركزي الخلوي. انقل تعليق الخلية إلى منفذ القمع للتجميع متبوعا بالطرد المركزي الخلوي.
تركز
قوة الطرد المركزي وتودع طبقة أحادية من الخلايا على منطقة دائرية على الشريحة. اعزل المنطقة المترسبة بالخلايا باستخدام عازل السيليكون. بمجرد أن تجف ، قم بإصلاح الخلايا باستخدام بارافورمالدهايد. بعد ذلك ، احتضان الخلايا بمحلول مانع مناسب يحتوي على بروتينات ترتبط بسهولة بأي مواقع ربط غير محددة على سطح الخلية.
الآن ، قم بتسمية الخلايا بمحلول جسم مضاد يحمل علامة الفلورسنت ذي الأهمية. تتعرف الأجسام المضادة الموسومة بالفلوروفور على جزيئات مستهدفة محددة على سطح الخلية وترتبط بها. اغسل العينة لإزالة أي أجسام مضادة غير مرتبطة. أضف محلول تركيب لإعداد العينة للتصوير.
استخدم مجهر مضان للكشف عن الضوء المنبعث من اقترانات الأجسام المضادة والفلوروفور المرتبطة بالمستضدات المستهدفة على الخلايا السرطانية. في هذا البروتوكول ، سنقوم بإجراء فحص التألق المناعي ل CTCs في عينات مرضى سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة.
- لتلوين التألق المناعي ، قم بحساب الخلايا في مقياس الدم ، وقم بتخفيف العينة المخصبة إلى 1 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل 100 ميكرولتر من تركيز محلول مضاد للارتباط بنسبة 0.2٪. بعد ذلك ، استخدم قطعة قطن مبللة ب 50 ميكرولتر من المحلول المضاد للربط لترطيب محيط غرفة العينة ووضع شريحة زجاجية بولي ليسين في غرفة العينة.
أغلق الحجرة، وقم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل ثلاث مرات لتغطية طرف الماصة الدقيقة بمحلول الربط قبل إعادة تعليق العينة في آخر 100 ميكرولتر من المادة الطافية. انقل محلول الخلية إلى غرفة العينة وقم بتدوير العينة في جهاز طرد مركزي مخصص بمعدل 400 دورة في الدقيقة لمدة 4 دقائق بتسارع منخفض.
في نهاية الطرد المركزي ، ضع عازل السيليكون حول منطقة الترسيب واترك الشريحة تجف تحت خزانة أمان ميكروبيولوجية لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، قم بإصلاح العينة المغزولة ب 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، تليها ثلاث غسلات لمدة دقيقتين مع 200 ميكرولتر من PBS لكل غسلة في درجة حرارة الغرفة.
بعد الغسيل الأخير ، قم بحظر أي ارتباط غير محدد بحضانة لمدة 30 دقيقة في كاشف الحجب في درجة حرارة الغرفة متبوعا بوضع العلامات ب 100 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد المعني. ضع الشريحة الملصقة في طبق بتري سعة 100 × 15 مل على قطعة من الورق الماص مبللة ب 2 مل من الماء المعقم ووضع الطبق مغلقا عند 4 درجات مئوية طوال الليل ، محميا من الضوء.
في صباح اليوم التالي ، اغسل العينة ثلاث مرات باستخدام PBS كما هو موضح وقم بتركيب العينة ب 10 ميكرولتر من محلول التثبيت المناسب وزلة غطاء زجاجي. ثم أغلق زلة الغطاء بطلاء أظافر شفاف.