تضخم الرئة الكاملة: طريقة لإعداد الرئتين للتصوير الحي خارج الجسم الحي

- أولا ، ضع فأرة قتلى رحيم على لوحة تشريح. فوق البطن مباشرة ، اقطع الجلد والصفاق. ثقب الحجاب الحاجز وقطع على طول الأضلاع والقفص الصدري حتى القصبة الهوائية. قم بعمل شق صغير في القصبة الهوائية. أدخل إبرة برفق داخل القصبة الهوائية دون إصابة الكارينا واربطها بالملقط. حقن درجة انصهار منخفضة الاغاروز في درجة حرارة الجسم الطبيعية داخل الرئتين. قم بإزالة المحقنة ببطء واحتفظ بالإبرة بالداخل لمنع ارتجاع الاغاروز.

صب PBS البارد على الرئتين لتعزيز تبلور الاغاروز. قم بإزالة الإبرة وربط القصبة الهوائية بالملقط لتجنب التدفق العكسي للأغاروز غير المتصلب. اقطع القص ، وأمسك القصبة الهوائية بالملقط ، واقطعها باستخدام المقص. اسحب الرئتين من تجويف الصدر. افصل الفصوص في الوسائط. ضع داخل آبار التصوير في ظروف فسيولوجية للفحص المجهري. يحافظ الاغاروز على مورفولوجيا الرئة في درجات حرارة فسيولوجية تساعد على مراقبة التفاعلات الخلوية الحية. في البروتوكول التالي ، سنعرض التصوير الحي خارج الجسم الحي للرئتين لدراسة التفاعلات بين الخلايا السرطانية والخلايا اللحمة.

- لتحضير الرئتين للتصوير الحي خارج الجسم الحي ، ابدأ بتثبيت الماوس على غطاء رغوة البوليسترين مغطى بقطعة من معتاد على الثمالة وتعقيم بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، باستخدام المقص الجراحي ، قم بعمل شق شرسوفي عرضي عبر الجلد ، متبوعا بشق مماثل عبر الصفاق. بعد ذلك ، قم بتحريك لوحة التشريح إلى وضع رأسي ، وقم بقطع الشريان الأورطي الهابط بحيث يتجمع الدم في البطن وليس في تجويف الصدر.

قص فتحة صغيرة في الحجاب الحاجز لتحرير الفراغ ، ثم قم بقص القفص الصدري لاستئصال الحجاب الحاجز وتصور الرئتين. باستخدام المقص الجراحي ، قم بقص الجلد حتى القصبة الهوائية فوق القفص الصدري ، مع ترك الأضلاع سليمة. ثم افصل الجلد عن القفص الصدري وقم بإزالة النسيج الضام المحيط لكشف القصبة الهوائية ، مع الحرص على عدم إتلاف القصبة الهوائية نفسها. قص فتحة صغيرة قطرها حوالي 1 ملليمتر في القصبة الهوائية المكشوفة الموازية للحلقات الغضروفية بالقرب من الحنجرة قدر الإمكان ، دون قطع القصبة الهوائية بالكامل.

ثم أدخل برفق إبرة قياس 20 من 4 إلى 5 ملليمترات في القصبة الهوائية دون أي قوة مضادة. يجب أن تكون نهاية الإبرة مرئية من خلال القصبة الهوائية. املأ حقنة ب 400 ميكرولتر من 37 درجة مئوية 2٪ درجة حرارة انصهار منخفضة ، ثم قم بتثبيت الإبرة بالملقط. الحفاظ على لوحة التشريح عمودية ، قم بغرس الكمية الكاملة من الاغاروز الدافئ ببطء من خلال الإبرة في الرئتين. بمجرد نفخ الرئتين ، افصل المحقنة مع الاحتفاظ بالإبرة داخل القصبة الهوائية واسكب ما يقرب من 50 مل من 20 درجة مئوية PBS على الرئتين للمساعدة في ضبط الاغاروز.

عندما يتجمد الاغاروز ، قم بإزالة الإبرة واستخدم الملقط لإغلاق القصبة الهوائية لمنع تسرب أي أغروز غير صلب. الآن ، افتح الصدر عن طريق بضع القص وأمسك القصبة الهوائية بالملقط. ثم ، باستخدام زوج من المقصات الجراحية ، قم بقطع القصبة الهوائية تماما. لإزالة الرئتين ، اسحب القصبة الهوائية برفق لأعلى ، وقطع النسيج الضام والمريء ، واسحب الرئتين تماما من تجويف الصدر.

اغمر الأنسجة في 37 درجة مئوية RPMI 1640 لغسل الدم الزائد. باستخدام المقص والملقط ، قم بقطع الشعب الهوائية الجذعية الرئيسية للفصوص عند النقير وافصل فصوص الرئة برفق. انقل الفصوص إلى بئر واحد من سطح مستو للوحة تصوير 24 بئرا لأسفل وقم بتغطية الأنسجة ب 100 ميكرولتر من 37 درجة مئوية RPMI 1640. ضع عدة شرائح غطاء مجهر دائري سعة 15 مليلتر فوق الفصوص لمنعها من الطفو ، واسكب PBS دافئا في الآبار المحيطة لمنع الوسط من التبخر. ثم أدخل اللوحة المكونة من 24 بئرا في غرفة المناخ ، وانقل الغرفة إلى مرحلة المجهر متحد البؤر.