لماذا يعد تحديد IC50 أمراً بالغ الأهمية قبل تصعيد الجرعة؟

يوفر تحديد قيمة IC50 المرجعية عبر مقايسة MTT تركيز المرجع لبدء تصعيد الجرعة عند 1/10 IC50، مما يضمن تطبيق ضغط انتقائي دون التسبب في سمية خلوية فورية. وهذا يتيح تطور المقاومة تدريجياً بمرور الوقت بدلاً من حدوث موت خلوي حاد.

كيف توضح نتائج مقايسة MTT تطور المقاومة؟

يقيس مقايسة MTT إنتاج الفورمازان الناتج عن نشاط مختزل الميتوكوندريا في الخلايا الحية، حيث ترتبط الكثافة الضوئية عند 570 nm بعدد الخلايا؛ ويتم تأكيد المقاومة عندما تحافظ الخلايا على حيويتها عند تركيزات متصاعدة من afatinib والتي كانت تثبط النمو في البداية.

ما الذي يتيح التكرار الموثوق لعملية تطوير خطوط خلوية مقاومة؟

يوفر التصعيد التدريجي للجرعة عند حالة دون الالتحام، مع زيادات في التركيز بنسبة 10-20% عند كل تمرير، بروتوكولاً موحداً للضغط الانتقائي يمكن تكراره عبر المختبرات لإنتاج نماذج مقاومة متماثلة جينياً.

لماذا تُعد متطلبات التكرار ضرورية للتعاون متعدد الوظائف؟

يضمن تطور المقاومة المتسق عبر المكررات أن الأنماط الظاهرية الملحوظة مدفوعة وراثياً وليست عشوائية، مما يتيح تسليماً موثوقاً بين فرق الاكتشاف وتطوير المقاييس والفرق قبل السريرية لدراسات التحقق من الهدف.

ما هو التحليل الإحصائي المطلوب لتأكيد تطور المقاومة؟

يتم تأكيد المقاومة من خلال مقارنة منحنيات الحيوية المستمدة من مقايسة MTT بين الخلايا الأصلية والخلايا التي تعرضت لجرعات متزايدة، وهو ما يتطلب إجراء اختبارات الدلالة الإحصائية (على سبيل المثال، تحليل إزاحة IC50) لإثبات انخفاض الحساسية للدواء بمرور الوقت.

تصاعد الجرعة: طريقة لتطوير مقاومة الأدوية في الخلايا السرطانية

JoVE Encyclopedia of Experiments

أبحاث السرطان

0 مشاهدات • 4:17 د • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- مثبطات التيروزين كيناز ، TKI ، تمنع مستقبلات كيناز من الارتباط ب ATP ، مما يمنع الفسفرة. ابدأ بطلاء الخلايا السرطانية في وسط النمو. اسمح لهم بالوصول إلى كثافة مواتية ، ونقل الخلايا إلى آبار متعددة. بعد النمو بين عشية وضحاها ، قم بتوزيع تركيزات مختلفة من الأدوية في آبار متعددة واترك الخلايا تنمو للمدة المطلوبة. أضف MTT ، وهي صبغة قابلة للذوبان في الماء ، لقياس صلاحية الخلية. تقوم إنزيمات الميتوكوندريا بتحويل MTT إلى فورمازان أرجواني غير قابل للذوبان داخل الخلايا الحية.

أوقف التفاعل عن طريق إضافة عامل مذاب مناسب وقياس الفورمازان الطيفي الضوئي. تسمى هذه الطريقة مقايسة MTT. ارسم رسما بيانيا للخلايا الحية المشار إليها بواسطة الفورمازان مقابل تركيزات الأدوية. احسب التركيز المثبط ، IC₅₀ ، من خلال إيجاد تركيز الدواء الذي يقتل 50٪ من الخلايا باستخدام البرنامج.

بعد ذلك ، قم بزراعة الخلايا السرطانية في وسط النمو وتوزيعها في ثلاث لوحات مختلفة. بعد أن تصل الخلايا إلى التقاء فرعي ، أضف 1/10 تخفيف تركيز IC₅₀. اسمح للخلايا بالنمو وإجراء اختبار MTT. كرر هذه العملية مع زيادة جرعة الدواء. تطور الخلايا السرطانية ببطء مقاومة ل TKIs بسبب الطفرات في تسلسل البروتين.

يوضح البروتوكول التالي تطور مقاومة الأفاتينيب في خلايا PC9 عن طريق تصعيد الجرعة.

- لتحديد تركيز مقاومة الأفاتينيب المناسب ، قم بزراعة خلايا PC9 في وسط النمو في طبق معالج بزراعة الخلايا 10 سم عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. أعد تعليق خلايا PC9 عند 4 أضعاف 10 إلى 4 خلايا لكل مليلتر من تركيز وسط النمو وبذر الخلايا عند 50 ميكرولترا من الخلايا المعلقة لكل بئر في صفيحة دقيقة 96 بئر. بعد حضانة ليلية في حاضنة زراعة الخلايا ، عالج الخلايا ب 50 ميكرولتر من محلول الأفاتينيب لكل بئر بستة مكررات من التركيزات المشار إليها. وبعد حضانة لمدة 96 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا ، أضف 15 ميكرولترا من صبغة MTT إلى كل بئر.

بعد أربع ساعات في حاضنة زراعة الخلايا ، أضف 100 ميكرولتر من محلول إيقاف الذوبان إلى كل بئر وأعد اللوحة إلى الحاضنة طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، قم بقياس الكثافة البصرية عند 570 نانومتر على قارئ الألواح الدقيقة. للتعرض المستمر للأفاتينيب ، قم بزراعة خلايا PC9 في أطباق P100 التي تحتوي على 10 مل من وسط النمو حتى تصل الخلايا إلى التقاء فرعي.

انقل الثقافات الفرعية إلى ثلاثة أطباق P100 جديدة سعة 9 مل من وسط النمو لكل طبق مزرعة أولي وأعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا. في صباح اليوم التالي ، أضف 0.1 نانومولار أو 1/10 من نصف الحد الأقصى للتركيز المثبط للأفاتينيب إلى كل مجموعة من ثلاثة أطباق استزراع. عندما تصبح الخلايا المعالجة بالأفاتينيب شبه ملتقية ، استخدم ماصة سعة 1 مليلتر لخلط الثقافات جيدا ونقل 1 ملليلتر من الخلايا من كل طبق إلى 9 ملليلتر من وسط النمو الطازج في أطباق P100 الجديدة.

أضف تركيزات أعلى من الأفاتينيب بنسبة 10٪ إلى 20٪ إلى المزارع الجديدة ، مما يزيد من تركيز الأفاتينيب عن طريق تصعيد الجرعة التدريجية في كل مرة تصل فيها المزارع إلى التقاء فرعي على مدى فترة تتراوح من 10 إلى 12 شهرا. عند الوصول إلى تركيز أفاتينيب يبلغ 1 ميكرومولار ، قم بإجراء اختبار MTT كما هو موضح للتأكد من أن الخلايا قد طورت مقاومة أفاتينيب.