JoVE Encyclopedia of Experiments
أبحاث السرطان
0 مشاهدات • 5:38 د • April 30th, 2023
- للبدء ، قم بزرع خلايا سرطان الرئة في قارورة على شكل حرف T تحتوي على وسط زراعة الأنسجة واتركها تنمو بين عشية وضحاها. بعد ذلك ، قم بتعليق miRNA بعامل تعدي في وسط تعداد. قم بإزالة الوسائط وإضافة وسيط نقل يدخل miRNA في الخلايا السرطانية. miRNA هو جزيء RNA غير مشفر يرتبط بتسلسل mRNA تكميلي ويمنع التعبير الجيني. احتضان القارورة للمدة المطلوبة.
بعد ذلك ، استبدل الوسائط بوسائط زراعة الأنسجة وتنمو بين عشية وضحاها. أضف التربسين لتفكك الخلايا. انقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على PBS وقم بطرده المركزي. قم بإزالة المادة الطافية وإضافة محلول التحلل إلى الخلايا المحللة وإضافة الإيثانول فائق النقاء لهطول الأمطار. ضع الخليط في عمود فصل لتنقية الحمض النووي وأجهزة الطرد المركزي.
قم بإزالة التدفق وإضافة مخزن مؤقت للغسيل لإزالة غشاء الخلية المحلل وجهاز الطرد المركزي. قم بإزالة مخزن الغسيل وأضف DNase مع المخزن المؤقت للهضم DNase لإزالة الحمض النووي من العينة وأجهزة الطرد المركزي. أضف المخزن المؤقت لإعداد الحمض النووي الريبي لعزل الحمض النووي الريبي وأجهزة الطرد المركزي. اجمع الحمض النووي الريبي الموجود في المادة الطافية. في البروتوكول التالي ، سنقوم باستخراج الحمض النووي الريبي من خلايا سرطان الرئة المعالجة بالحمض النووي الريبي.
- أولا ، قم بزرع الخلايا السرطانية في قارورة مناسبة كافية لاستخراج الحمض النووي الريبي والبروتين لإجراء التعبير الجيني باستخدام qPCR أو تحليل المصفوفات الدقيقة. ثم احتضنها طوال الليل مع وسائط مكملة بنسبة 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
في اليوم التالي ، قم بإعداد عينة microRNA للتعداء عن طريق تخفيف microRNA 143 و microRNA 506 في الوسائط ، بتركيز 100 نانومولار لكل منهما. أخرج القارورة من الحاضنة ، وقم بإزالة الوسائط. يغسل مع 1 × PBS.
ستحتوي جميع عناصر التحكم غير المعالجة على وسائط غير مكتملة مع خلايا فقط. احتضان الخلايا بوسائط التعدي لمدة ست ساعات في حاضنة. بعد ست ساعات ، قم بإزالة الوسائط واستبدلها ب 4 ملليلتر من الوسائط الكاملة الطازجة. حصاد الخلايا بعد 24 ساعة و 48 ساعة عن طريق التربسين.
بعد ذلك ، اغسل مرتين باستخدام 1x PBS في كل أنبوب ، وقم بإزالة المادة الطافية. من أجل إجراء استخراج الحمض النووي الريبي في وقت لاحق ، قم بتجميد الخلايا عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
- تم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة الحمض النووي الريبي ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم أولا بإزالة الأنابيب من 80 درجة مئوية تحت الصفر واتركها تذوب.
- أضف 300 ميكرولتر من محلول التحلل والماصة لأعلى ولأسفل لكسر غشاء الخلية. أضف حجما متساويا من الإيثانول النقي للغاية بنسبة 100٪. ثم تخلط جيدا وتوضع في العمود الفاصل. جهاز الطرد المركزي وإزالة التدفق من خلال.
أضف 400 ميكرولتر من عازلة الغسيل وأجهزة الطرد المركزي لإزالة المخزن المؤقت. أضف 5 ميكرولترات من DNAse I مع 75 ميكرولترا من المخزن المؤقت لهضم الحمض النووي في كل عينة واحتضنه لمدة 15 دقيقة. ثم اغسل العينة بمخزن مؤقت 400 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي.
بعد ذلك ، اغسل مرتين باستخدام مخزن غسيل الحمض النووي الريبي. أضف الآن الماء الخالي من النوكلياز إلى العمود ، وجهاز الطرد المركزي ثم اجمع الحمض النووي الريبي. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي ، في هذه المرحلة ، يمكن إرسال 2 ميكروغرام من عينة الحمض النووي الريبي لتسلسل الحمض النووي الريبي.