تحضير رئة الفأر لقياس التدفق الخلوي: توليد تعليق الخلية من أنسجة الرئة لتحليل قياس التدفق الخلوي

- ابدأ بأخذ فأر قتل رحيم وقم بتثبيته على لوحة تشريح بشريط مختبر. استخدم المقص لقطع الجلد. قم بعمل شق عمودي عبر الحجاب الحاجز وقطع الأضلاع للوصول إلى التجويف الصدري الذي يعرض القلب والرئتين. بعد ذلك ، قم بعمل شق صغير في البطين الأيسر للقلب. بعد ذلك ، حدد موقع البطين الأيمن وأدخل حقنة تحتوي على PBS في تجويف البطين. قم بنشر PBS من خلال البطين الأيمن للسماح للدم بالتدفق من الشق المعد مسبقا في البطين الأيسر حتى تتحول الرئتان إلى اللون الأبيض. أخرج أنسجة الرئة التي تحتوي على عقيدات الورم وفرم إلى قطع صغيرة.

احتضان القطع في المخزن المؤقت لهضم الرئة. يساعد الكولاجيناز الموجود في المخزن المؤقت لهضم الرئة على عزل الخلايا ، ويساعد الحمض النووي على التخلص من الحمض النووي من الخلايا الميتة. قم بتصفية التعليق الناتج من خلال مصفاة خلية لإزالة الكتل وجعل تعليق الخلية موحدا. جهاز طرد مركزي وإعادة تعليق الحبيبات في محلول كلوريد الأمونيوم للبوتاسيوم لتحلل كريات الدم الحمراء المتبقية. جهاز طرد مركزي لجمع كرات الدم البيضاء والخلايا السرطانية في الحبيبات. أعد تعليق الحبيبات في PBS المكملة ب FCS ، للحفاظ على استقرار الخلية. في البروتوكول التالي ، سنوضح تحضير تعليق خلايا الرئة لتحليل قياس التدفق الخلوي.

بعد نقطة النهاية التجريبية المناسبة ، انقع الذبيحة في 70٪ من الإيثانول وقم بتأمين في لوحة التشريح. قم بعمل شق بطني في خط الوسط واقلب الجلد برفق لكشف عضلات جدار الصدر وأعضاء البطن. استخدم المقص لثقب الحجاب الحاجز وقطع الأضلاع التي تعرض التجويف الصدري. اقطع فتحة صغيرة في البطين الأيسر واستخدم إبرة قياس 27 لاختراق الرئة ثلاث مرات من خلال البطين الأيمن مع 6 إلى 8 ملليلتر من PBS المثلج لكل تسريب. بعد التروية الأخيرة ، يجب أن تكون الرئتان خالية تماما من الدم وتبدو بيضاء. بعد الحصاد ، استخدم المقص لفرم أنسجة الرئة إلى قطع صغيرة.

نقل شظايا الرئة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مليلتر يحتوي على 1.5 مل من محلول هضم الرئة لمدة 30 إلى 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الرج. في نهاية عملية الهضم ، انقل معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون إلى أنبوب سعة 50 مليلتر ، واستخدم نهاية مكبس حقنة معقمة سعة 10 مليلتر للضغط على أي شظايا أنسجة متبقية من خلال الفلتر. اشطف المصفاة ب 15 مل من PBS مكملا بنسبة 2٪ FCS ، واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من محلول تحلل البوتاسيوم كلوريد الأمونيوم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى. ثم أعد تعليق حبيبات خلايا الدم البيضاء في 1 مليلتر من PBS مكمل بنسبة 2٪ FCS ، وصمة عار الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي وفقا للبروتوكول التجريبي.