موسوعة JoVE للتجارب
أبحاث السرطان
0 مشاهدة • 4:11 دقيقة • April 30th, 2023
- مقايسة تكوين المستعمرة عبارة عن تحليل في المختبر لدواء مضاد للسرطان على نمو الخلية السرطانية ، وتكاثرها وتمايزها إلى مستعمرات في وسط شبه صلب. للبدء ، قم بزراعة الخلايا السرطانية في وسط RPMI مع مكمل النمو - مصل الأبقار الجنيني ، أو FBS ، والمضادات الحيوية. احتضان الخلايا للمدة المطلوبة.
بعد ذلك ، اجمع التركيز المطلوب للخلايا في أنبوب الطرد الصغير وجهاز الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في PBS. قم بإعداد وسط قائم على ميثيل السليلوز ، وقم بتوزيعه على أنابيب مختلفة باستخدام FBS لتعزيز النمو الأمثل.
أضف كمية مناسبة من تعليق الخلية في الأنابيب ، وقم بدوامها لخلط الخلايا مع الوسط. بعد ذلك ، أضف مركبات مضادة للسرطان في الأنابيب ، وقم بإعداد عنصر تحكم عن طريق إضافة DMSO. أنابيب دوامة.
أضف خليط الخلية هذا إلى لوحة الثقافة ، واحتضنه للمدة المطلوبة. بعد الحضانة ، أضف ميثيل ثيازول ديفينيل تيرازوليوم بروميد ، أو MTT ، واحتضنه لبعض الوقت. يقلل MTT من ملح التيترازوليوم الأصفر في الخلايا القابلة للحياة إلى بلورات فورمازان الأرجواني. تتحول المستعمرات القابلة للحياة إلى اللون البنفسجي. التقط الصور باستخدام كاميرا رقمية ، وحلل المستعمرات القابلة للحياة. في البروتوكول التالي ، سوف ندرس مقايسة تكوين المستعمرة لتقييم نشاط محاكات هيدروكسي كومارين OT48 و BH3 في سرطان الرئة.
- للبدء ، قم بلوحة 20,000 خلية A549 لكل سنتيمتر مربع في 15 مل من وسط زراعة الخلايا RPMI 1640 ، مع استكمال 10٪ FBS و 1٪ مضادات حيوية في قارورة مساحتها 75 سم مربع. احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. في يوم التجربة ، استخدم مقياس الدم لتحديد تركيز الخلية.
اجمع 50,000 خلية في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر عن طريق الطرد المركزي عند 400 جم لمدة سبع دقائق. وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 1X PBS المعقمة. باستخدام ماصة متعددة ، قم بتوزيع 1.1 مل من الوسط شبه الصلب القائم على ميثيل السليلوز ، أو MCBM ، في أنابيب ، مع إعداد أنبوب واحد لكل حالة. ثم أضف 110 ميكرولتر من FBS إلى كل أنبوب.
بعد ذلك ، قم بزراعة 1,000 خلية في المليلتر. بعد ذلك ، قم بإدخال 2.4 ميكرولتر من محلول خلية المخزون في أنابيب MCBM و FBS. بعد إضافة الخلايا ، أمسك الأنابيب عموديا وقم بدوامها بأعلى سرعة لمدة دقيقة واحدة لخلط MCBM والخلايا جيدا.
الآن ، أضف مركب الاختبار OT48 وحده ، أو بالاشتراك مع A1210477 ، إلى العينات. قم بإعداد أنبوب منفصل كعنصر تحكم للمذيب المستخدم ، مثل DMSO. ثم دوامة العينات لمدة دقيقة واحدة.
لكل فحصة، ضع ماصة ملليلتر واحد من الخليط في البئر الأوسط للوحة زراعة الخلايا المكونة من 12 بئرا. ثم استخدم ملليلتر واحد من الماء المعقم أو PBS لملء الآبار الفارغة. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 10 أيام. ثم أضف 200 ميكرولتر من محلول مخزون MTT بسعة خمسة ملليغرام لكل مليلتر إلى كل بئر. بعد احتضان الألواح لمدة 10 دقائق ، تحقق من وجود مستعمرات قابلة للحياة ، والتي ستتحول إلى اللون البنفسجي.