موسوعة JoVE للتجارب
أبحاث السرطان
0 مشاهدة • 5:08 دقيقة • April 30th, 2023
- العلاج الضوئي الديناميكي أو PDT هو نوع من العلاج بالضوء باستخدام المحسسات الضوئية - الجزيئات التي يتم تنشيطها بواسطة أضواء ذات أطوال موجية محددة. يقوم المحسس الضوئي المتحمس بتحويل الأكسجين الجزيئي الموجود في الخلايا إلى أنواع أكسجين تفاعلية تسبب موت الخلايا. لبدء الفحص ، قم بإعداد نظام توصيل الدواء المطلوب القائم على الجسيمات النانوية الذي يحمل التركيز المناسب للحساس الضوئي ، بمفرده أو بالاشتراك مع دواء اختبار.
أضف التركيز المفضل لهذا المعلق من الجسيمات النانوية في ثقافة خلايا سرطان الرئة. احتضان الثقافة في الظلام لفترة مناسبة لتسهيل امتصاص الجسيمات النانوية الخلوية. استبدل التعليق بوسط الثقافة المطلوب. بعد ذلك ، ضع ليزر ألياف العلاج الضوئي فوق المزرعة على مسافة مثالية لتسهيل الإضاءة الموحدة. تشعيع الخلايا بطول موجي مناسب للوقت المطلوب واحتضانها طوال الليل.
استبدل الوسائط بمحلول مناسب لقياس السمية الخلوية. استخدم قارئ صفيحة دقيقة لقياس قابلية الخلية للحياة وتحديد التأثيرات السامة للخلايا للعلاج التجريبي. تظهر الخلايا المشععة التي تحتوي على المحسس الضوئي انخفاضا في الجدوى. في البروتوكول التالي ، سنقوم بإجراء تحليل السمية الضوئية في المختبر للهيبوكريلين B ، وهو محسس للضوء ، وباكليتاكسيل ، وهو دواء مضاد للسرطان ، مغلف في جزيئات حمض الهيالورونيك والسيراميد النانوية في خلايا سرطان الرئة A549.
- للبدء ، قم بتصنيع حمض الهيالورونيك سيراميد كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. قم بتنقية المنتج باستخدام غشاء غسيل الكلى 3.5 كيلو دالتون وتجفيده.
بعد ذلك ، قم بإعداد الجسيمات النانوية لحمض الهيالورونيك والسيراميد بمفردها ، وجسيمات حمض الهيالورونيك والسيراميد النانوية جنبا إلى جنب مع المحسس الضوئي ، وجسيمات حمض الهيالورونيك والسيراميد النانوية مع عامل مضاد للسرطان ومحسس للضوء.
بذر خط خلايا سرطان الرئة A549 في آبار صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا بكثافة 1 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر ، واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، قم بإزالة الوسيط وغسل الخلايا ب 1 مليلتر من PBS.
ثم قم بإذابة الجسيمات النانوية المحضرة في PBS إلى تركيز نهائي قدره 2 ميكرومول لكل مليلتر من المحسس الضوئي ، hypocrellin B ، عن طريق الدوامة.
في أربعة آبار لكل منها ، أضف 1 مليلتر من PBS ، و 1 مليلتر من الجسيمات النانوية الفارغة لحمض الهيالورونيك والسيراميد ، و 1 مليلتر من الجسيمات النانوية التي تحتوي على المحسس الضوئي ، و 1 مليلتر من الجسيمات النانوية التي تحتوي على كل من المحسس الضوئي والدواء المضاد للسرطان.
عند الانتهاء ، قم بتغطية اللوحة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات في الظلام للسماح بامتصاص الجسيمات النانوية في الخلايا. ثم قم بإزالة جميع المحاليل وغسل الخلايا بإضافة 1 مليلتر من PBS البارد.
كرر خطوة الغسيل مرة أخرى ، ثم أضف وسط ثقافة جديد. بعد ذلك ، ضع لوحة الثقافة المكونة من 24 بئرا تحت ألياف العلاج الضوئي ووضع الألياف على بعد 1 سم من البئر الأول.
- كانت المسافة من ألياف العلاج الضوئي الديناميكي إلى الخلايا هي العامل الحاسم في هذه الدراسة. كان من المهم معرفة المسافة المثلى التي يمكن أن تغطي الخلية بأكملها بالضوء.
- ثم ارتد نظارات السلامة وأطفئ الأنوار. قم بإضاءة الخلايا بالليزر في الظلام لمدة تتراوح بين 5 و 40 ثانية لتنشيط الأكسجين المفرد عالي التفاعل والجذور الحرة الأخرى في الجسيمات النانوية المحتوية على المحسس الضوئي.
بعد التعرض للضوء ، احتضن الخلايا في الظلام لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، قم بشفط وسط الثقافة واغسل الخلايا ب 1 ملليلتر من PBS البارد. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى ثم أضف 100 ميكرولتر من الوسائط و 10 ميكرولتر من محلول قياس السمية الخلوية لكل بئر.
احتضان الخلايا في المحلول لمدة ساعتين في الظلام ثم انقل جميع العينات إلى صفيحة 96 بئرا. قم بقياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.