عزل الإكسوسوم: تقنية لفصل الإكسوسومات عن بلازما مرضى سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة
JoVE Encyclopedia of Experiments
أبحاث السرطان
0 مشاهدات • 4:21 د • April 30th, 2023
- الإكسوسومات عبارة عن حويصلات صغيرة مرتبطة بالغشاء تحمل جزيئات حيوية مثل الدهون والبروتينات والحمض النووي والحمض النووي المرسال والحمض النووي الريبي الميكرورينا. يتم إطلاق الإكسوسومات بواسطة أنواع مختلفة من الخلايا في المساحات خارج الخلية ويمكن عزلها عن السوائل الحيوية مثل البلازما.
للبدء ، قم بالطرد المركزي لعينة البلازما لإزالة الخلايا والحطام. انقل المادة الطافية في البلازما إلى أنبوب جديد. عالج البلازما بالتركيز المطلوب من إنزيم الريبونوكلياز. احتضان العينة على كتلة تسخين عند 37 درجة مئوية لمدة مناسبة.
يحلل الإنزيم أي حمض نووي حر في العينة ، بينما يظل الحمض النووي الريبي الخارجي محميا. تمييع العينة باستخدام PBS. بعد ذلك ، أضف التركيز المطلوب من محلول إنزيم Proteinase K واحتضنه عند 37 درجة مئوية لفترة مناسبة. يحلل البروتيناز K الجزء الأكبر من بروتينات البلازما. كما أنه يعطل إنزيم الريبونوكلياز المضاف سابقا ، وبالتالي القضاء على خطر تدهور الحمض النووي الريبي الخارجي أثناء المعالجة النهائية
أضف حجما مناسبا من المخزن المؤقت لهطول الأمطار لتسهيل فصل الإكسوسوم عن البلازما. الطرد المركزي للعينة للحصول على حبيبات تحتوي على الإكسوسومات السليمة. تجد الإكسوسومات المعزولة تطبيقات في خطوات المصب مثل استخراج الحمض النووي الريبي والبروتين.
في البروتوكول التالي ، سنقوم بعزل الإكسوسوم من عينة البلازما لمرضى سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة.
- للبدء ، قم بإذابة عينة بلازما سعة 1 مليلتر على الجليد. بمجرد إذابته ، اقلب الأنبوب عدة مرات لتفكيك أي ترسبات تبريد قد تكون قد تشكلت. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للبلازما عند 2,000 Gs لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، من أجل إزالة الخلايا والحطام. اجمع المادة الطافية وأجهزة الطرد المركزي للبلازما مرة أخرى ، الآن عند 10,000 Gs لمدة 20 دقيقة. مرة أخرى ، اجمع المادة المطفية في البلازما وأضف الآن 10 ميكرولتر من RNAse. احتضان البلازما عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في سخان الكتلة الحرارية.
- أضفنا خطوة معالجة RNAse إلى بروتوكول المجموعة القياسي من أجل تحلل microRNAs الحرة. في وقت لاحق ، تم استغلال خطوة علاج البروتيناز K ، المضمنة في بروتوكول المجموعة من أجل تحلل RNAse وحماية سلامة الحمض النووي الريبي الميكروي الإغزومي.
- بعد ذلك ، انقل البلازما إلى أنبوب جديد بنصف حجم 1x PBS وقم بدوامها. ثم أضف 0.05 محضر من محلول البروتيناز K ، وقم بتدوير العينة مرة أخرى واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الآن ، أضف 0.2 وحدة تخزين من المخزن المؤقت لهطول الأمطار الخارجية واخلط العينة عن طريق الانعكاس. ثم احتضان العينة عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
بعد الحضانة الباردة ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 10,000 Gs لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. خذ 20 إلى 50 ميكرولترا من المادة الطافية وقم بتخزينها لأغراض التحكم. ثم استنشق وتخلص من المادة الطافية المتبقية.
أعد تعليق حبيبات الإكسوسوم في المخزن المؤقت المفضل ، بحجم يعتمد على التحليل النهائي. لتحليل الحمض النووي الريبي ، أضف مخزن مؤقت محدد للتحلل لاستخراج الحمض النووي الريبي.
نظرة عامة
تتناول هذه المقالة عملية عزل الإكسوزومات (exosomes) من عينات البلازما، وتحديداً من المرضى المصابين بسرطان الرئة غير صغير الخلايا. تُعد الإكسوزومات حويصلات صغيرة تحمل جزيئات حيوية متنوعة وتلعب دوراً هاماً في التواصل بين الخلايا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علوم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- علم الأورام
خلفية علمية
- الإكسوزومات هي حويصلات محاطة بغشاء تفرزها الخلايا.
- وهي تحتوي على ليبيدات وبروتينات وDNA وmRNA وmicroRNA.
- يمكن فصل الإكسوزومات من السوائل الحيوية مثل البلازما.
- تعد تقنيات الفصل أمراً بالغ الأهمية لدراسة محتويات الإكسوزومات.
الغرض من الدراسة
- تقديم بروتوكول مفصل لعزل الإكسوسومات من البلازما.
- تعزيز فهم سلامة الحمض النووي الريبوزي (RNA) الإكسوسومي أثناء المعالجة.
- تسهيل التطبيقات اللاحقة مثل استخلاص البروتين والحمض النووي الريبوزي (RNA).
الطرق المستخدمة
- طرد مركزي للبلازما لإزالة الخلايا والبقايا الخلوية.
- المعالجة باستخدام الريبونوكلياز لتكسير الحمض النووي الريبوزي (RNA) الحر.
- استخدام Proteinase K لحماية الحمض النووي الريبوزي (RNA) الإكسوزومي.
- ترسيب الإكسوزومات وعزلها عن طريق الطرد المركزي.
النتائج الرئيسية
- عزل ناجح للإكسوزومات السليمة من عينات البلازما.
- الحفاظ على سلامة الرنا (RNA) الإكسوزومي أثناء المعالجة.
- يتيح البروتوكول إجراء تحليلات لاحقة فعالة.
الاستنتاجات
- يعد البروتوكول الموصوف فعالاً لعزل الإكسوزومات.
- وهو يعزز من موثوقية دراسات الحمض النووي الريبوزي (RNA) الخاص بالإكسوزومات.
- ومن الممكن إجراء المزيد من التطبيقات في أبحاث السرطان.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يُتيح العزل الموثوق للإكسوسومات من البلازما الوصول غير الجراحي إلى المؤشرات الحيوية الجزيئية، مما يدعم الكشف المبكر والمراقبة الطولية في أبحاث الأورام. ويعزز سير العمل هذا الثقة التنبؤية في اكتشاف المؤشرات الحيوية والدراسات الانتقالية من خلال الحفاظ على سلامة البروتينات والحمض النووي الريبوزي (RNA) الخاص بالإكسوسومات. وتضع هذه الطريقة الخزعة السائلة القائمة على الإكسوسومات كأداة قابلة للتوسع للتحقق من صحة المؤشرات الحيوية على نطاق واسع وتتبع تطور المرض.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح استجواب حمولة البروتينات والرنا (RNA) الإكسوزومية المتداولة للتحقق من الهدف.
- يدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال عزل الحويصلات ذات الصلة بالمرض من بلازما المرضى.
- يعزز الثقة التنبؤية في تحديد المؤشرات الحيوية لمسارات تطوير أدوية الأورام.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر تحضيرات معيارية من الإكسوسومات لإجراء المقاييس الجزيئية اللاحقة.
- يضمن قابلية التكرار والاتساق الكمي في استخلاص الحمض النووي الريبي (RNA) والبروتين من الإكسوسومات.
- يجهز عينات مناسبة للفحص عالي الإنتاجية للمؤشرات الحيوية المرشحة.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- يتماشى مع استراتيجيات المؤشرات الحيوية الانتقالية من خلال تمكين أخذ عينات متسلسلة من المرضى.
- يحافظ على الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف إلى التحقق قبل السريري من المؤشرات المشتقة من الإكسوسومات.
- يقلل من المخاطر عند نقل المؤشرات الحيوية المرشحة إلى التقييم السريري.
تكامل مسارات العمل والتدفق
يدمج بروتوكول عزل الإكسوسومات هذا بين بيولوجيا الاكتشاف والأبحاث الانتقالية، مما يدعم سير العمل بدءاً من التحديد المبكر للمؤشرات الحيوية وصولاً إلى التحقق من الصلاحية قبل السريرية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تتيح اختبار الفرضيات حول حمولة الإكسوسومات كمؤشرات مرضية.
- المسح: توفر عينات إكسوسومات قابلة للتكرار لتطوير المقايسات والتحقق من صحتها.
- التحليلات: تدعم القياس الكمي لبروتين وRNA الإكسوسومي للدراسات المقارنة.
- الأبحاث الانتقالية: تسهل مواءمة مؤشرات الخزعة السائلة مع نماذج تطور المرض.
- إعادة الاستخدام في المؤسسة: تضع بروتوكولاً قابلاً لإعادة الاستخدام لعزل الإكسوسومات عبر مجالات مرضية ودراسات متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في اكتشاف المؤشرات الحيوية والتحقق من الأهداف.
- القيمة التشغيلية: توحد عملية عزل الإكسوسومات لضمان سير عمل قابل للتكرار والتوسع.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تمكين تحليل قوي وغير جراحي للمؤشرات الحيوية.
- تأثير المحفظة: تدعم ترتيب أولويات المرشحين للمؤشرات الحيوية للمضي قدماً بناءً على تقييم المخاطر.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع البلازما وبيولوجيا الإكسوزومات.
- يتطلب الوصول إلى أجهزة الطرد المركزي والبنية التحتية للتحليل الجزيئي.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق لمعالجة العينات وتفسير البيانات.
- قابل للتكيف مع أحجام البلازما المختلفة والمتطلبات التحليلية اللاحقة.
- يعتمد على المعالجة الإنزيمية الدقيقة للحفاظ على سلامة الـ RNA الإكسوزومي.
الأسئلة الشائعة حول المستحضرات الدوائية الحيوية
طريقة سريعة والمبسطة لارتفاع العزلة من خلال وضع-من ميرنا من نظافة البروتين الدهني عالي الكثافة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
هضم البروتين، أولترافيلتراتيون، وحجم الاستبعاد اللوني لتحسين عزل اكسوسوميس من بلازما الدم البشري والمصل
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
باستخدام نانوبلازمون-تعزيز تشتت والتصوير المجهر منخفضه التكبير لقياس الأورام المشتقة من الورم
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
استخراج الإكسوسوم القائم على الخرز المغناطيسي: تقنية لعزل إكسوسومات معينة من السوائل الحيوية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
طريقة مبتكرة لExosome الكمي وقياس الحجم
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
عزل Exosomes من البلازما من HIV-1 الأفراد ايجابية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
Exosomal تحليل ميرنا في الخلية غير الصغيرة سرطان الرئة (NSCLC) المرضى البلازما من خلال QPCR: والممكنة السائل أداة خزعة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
العزلة ومن التنميط Exosomes من الصفراء الإنسان التي تحتوي على الرنا الميكروي
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
إعداد اكسوسوميس ل siRNA إيصالها إلى "الخلايا السرطانية"
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
استخراج الحويصلات خارج الخلية من الأنسجة كاملة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
آخر تحديث: 29 أغسطس 2026