موسوعة JoVE للتجارب
أبحاث السرطان
0 مشاهدة • 4:17 دقيقة • April 30th, 2023
- أولا ، ضع شريحة مناديل على ورق ترشيح مبلل ب PBS لمنع انكماش الخلية أو تورمها عن طريق موازنة الأسمولية. انقل الأنسجة إلى شريط هيستو. أغلق الكاسيت وضعه في محلول فورمالين محايد مخزن مؤقت. يحتوي NBF على الفورمالديهايد الذي يرتبط بالمجموعات الأمينية من الأحماض الأمينية ويمنع تكوين حمض الفورميك الذي يصطباغ الأنسجة. اترك الكاسيت طوال الليل عند درجة حرارة منخفضة ، مما يمنع تدهور الحمض النووي ويصلح الأنسجة. جفف الأنسجة بغسلات متعددة من الكحول.
ضعه في البارافين السائل واضغط عليه لأسفل حتى قاع القالب. قم بإزالة الوزن وضع الجزء السفلي من كاسيت النوسجي على المنديل. صب البارافين السائل على التجميع. اسمح للإعداد بالتصلب على طبق بارد. البارافين غير قابل للذوبان في الماء ، وبعد دخوله الأنسجة المجففة يتصلب ويساعد في التقسيم. انقل كتلة الأنسجة على ميكروتوم. قص وجمع أجزاء رقيقة من الأنسجة على شريحة. إذا كان القسم سميكا جدا ، فلا يمكن أن ينتشر الأكسجين والعناصر الغذائية الأخرى عبر الشريحة مما يخلق تدرجا نابسا للنخر الكاذب. إذا كان القسم رقيقا جدا ، فإنه يميل إلى التجعيد. يفحص فيديو البروتوكول تعبير المؤشرات الحيوية وقابلية الخلية للحياة من أنسجة FFPE لسرطان الرئة.
- لبدء تثبيت الشريحة المرغوبة ، انقلها بعناية باستخدام ملقط إلى صفيحة بحجم 10 سم تحتوي على ورق ترشيح مبلل مملوء ب 2 إلى 3 ملليلتر PBS واتركها تطفو. ثم ارفع ورق الترشيح بزوج من الملقط وضعه في علبة هيستو. انقل ورق الترشيح إلى علبة هيستو. أضف قطرة من الهيماتوكسيلين المخفف أعلى شريحة الأنسجة لتحديد موضع الشريحة للخطوات اللاحقة. أغلق الكاسيت وانقله إلى محلول فورمالين محايد 4٪ واتركه طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد غسل الكاسيت ومعالجته كما هو موضح في البروتوكول ، افتح كاسيت النوسج واستخدم مشرطا لرفع الشريحة الثابتة بعناية من ورق الترشيح. تخلص من ورق الترشيح وانقل الشريحة إلى قالب يحتوي على البارافين السائل.
استخدم وزنا مسطحا للضغط على الأنسجة على الجزء السفلي من قالب التضمين لضمان التقسيم المتساوي. ضع الجزء السفلي من كاسيت النوسط فوق القالب ، وأضف البارافين السائل فوقه ، واترك القالب يبرد على طبق بارد لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، افصل القالب المبرد عن كتلة البارافين. استخدم ميكروتوم لتحضير أقسام رقيقة 4 ميكرومتر من كتل شرائح أنسجة FFPE. تقليم فائض البارافين المحيط بالأنسجة. للحصول على أقسام متساوية في جميع أنحاء الأنسجة ، اضبط زاوية الكتلة بحيث يكون سطح الكتلة موجها أفقيا فيما يتعلق بالشفرة. باستخدام فرشاة رفيعة ، اجمع أقسام الأنسجة المتسلسلة من شريحة الأنسجة المضمنة في البارافين بدءا من الجزء العلوي من الشرائح الزجاجية. استمر في جمع أقسام طبقات الأنسجة العميقة إلى المنتصف متبوعا بالجزء السفلي من الشرائح الزجاجية.
- يتم جمع الأقسام من طبقات مختلفة من كل شريحة أنسجة إلى شرائح الكائن لتمكين التقاط التدرجات المحتملة المستحثة عن الثقافة في الجدوى أو هجرة الخلايا أو التعبير عن العلامات الحيوية.
- بعد جمع الأقسام ، استمر في معالجتها وتحليلها بشكل إضافي كما هو موضح في البروتوكول.