مقارن في الجسم الحي دراسة gp96 Adjuvanticity في الضفدع القيطم المورق

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة القدرة الحفظية التطورية لبروتين الصدمة الحرارية GP96 على تعزيز استجابات خلايا T CD8 النوعية للمستضد في ضفادع Xenopus laevis. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق جمع الكريات البيضاء البريتونية من خلال غسيل الصفاق. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تحميل الكريات البيضاء البريتونية ببروتين GP96 المشتق من الورم، والذي يعمل كمرافق للمستضدات الثانوية والمستضدات الورمية، وذلك بعد عملية الحضن والغسل.

يتم نقل كريات الدم البيضاء البريتونية تكييفياً عن طريق الحقن داخل التجويف البريتوني في ضفادع سليمة من أجل تحفيز هذه الضفادع ضد الأورام أو مستضدات التوافق النسيجي الصغرى. وتتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إما إجراء تطعيم جلدي أو تعريض الضفادع المحفزة للتحدي الورمي، ومراقبة بداية رفض التطعيم الجلدي أو ظهور الورم. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي الحصول على دم محيطي لتوصيف الخلايا التائية المشاركة في استجابات رفض الجلد والاستجابات المضادة للأورام.

في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تُظهر تسارعاً ملحوظاً في رفض طعم الجلد، فضلاً عن تأخر في ظهور الورم في الضفادع التي تم تحفيزها بـ GP 96 من خلال اختبارات زراعة الجلد وتحدي الورم على التوالي. مرحباً، أنا كريستينا كوسكا من مختبر الدكتور جاك روبرت في قسم الميكروبيولوجيا والمناعة في المركز الطبي بجامعة روتشستر. وأنا تانيا كروز أيضاً من مختبر الدكتور ريفرز.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحفيز الضفادع المستنسخة عن طريق النقل التكيفي لكريات الدم البيضاء البريتونية، يليه اختبارات تطعيم الجلد وزرع الأورام. بالإضافة إلى ذلك، سنوضح لكم كيفية الحصول على الدم المحيطي من هذه الحيوانات. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة قدرة بروتين الصدمة الحرارية GP 96 على تعزيز خلايا CDAT النوعية للمستضد في Salla، وكذلك لدراسة أنواع الخلايا المشاركة.

حسناً، لنبدأ الآن. الضفادع المستخدمة في تجاربنا هي مستنسخات متطابقة جينياً (ISO genetic clones) من مستعمرة التربية الخاصة بنا في جامعة روتشستر. لاستحثاث كريات الدم البيضاء البريتونية أو pls لغرض الحصاد، استخدم إبرة قياس 25 وعيار 5/8 لحقن الضفدع المخدر داخل البريتون بمستحضر من بكتيريا e coli المقتولة حرارياً. وبعد ثلاثة أيام من الحقن، يتم حصاد pls عن طريق الغسل داخل البريتون.

لبدء هذا الإجراء، قم بتطهير بطن الضفدع المخدر بكمية صغيرة من 70%ethanol. ثم استخدم إبرة مقاس 18 وبطول 1.5 لحقن خمسة ملليلترات من المحلول الملحي الفوسفاتي المنظم المعقم للبرمائيات، أو PBS تم تسخينه مسبقاً إلى درجة حرارة الغرفة، في التجويف البريتوني. قم بإزالة الإبرة ودلك الضفدع برفق لمدة دقيقة لضمان امتزاج المحلول المنظم المحقون مع السوائل الموجودة في تجويف الجسم.

بعد ذلك، أدخل إبرة جديدة مقاس 18 وعيار 1.5 بدون محقنة في بطن الضفدع. وقم بجمع السائل البريتوني الذي سيقطر من مؤخرة الإبرة في أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 milliliter، مع تجنب الأوعية الدموية. تأكد من استعادة أكبر قدر ممكن من الحجم المحقون أوليًا بعد جمع الـ pls.

ضع الضفدع في وعاء به ماء ضحل حتى يستيقظ، وعند هذه النقطة يمكن إعادته إلى قفصه. بمجرد حصاد pls، قم بإجراء الطرد المركزي بسرعة 1000 RPM لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية، ثم قم بإزالة sup و natant و resus. قم بتعليق pls في A PBS بارد.

انقل الخلايا المعاد تعليقها إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 milliliter. لنبض الخلايا باستخدام GP 96، أضف الكمية المناسبة من GP 96 إلى الخلايا واخلط عن طريق الماصة، ثم حضن المزيج على الثلج لمدة ساعة واحدة.

قم بطرد الخلايا مركزياً عند 14,000 RPM لمدة دقيقة واحدة. ولإزالة أي GP 96 غير مرتبط، قم بإزالة الطافي. أضف PBS بارداً وأعد التعليق.

قم بتعليق خلايا PLS باستخدام جهاز الطرد المركزي مرة أخرى. اغسل S باستخدام A-P-B-S-A البارد ثلاث مرات إجمالاً للتأكد من عدم وجود أي G 96 متبقٍ بعد الغسلة النهائية. أعد تعليق PLS النبضية بتركيز 5 × 10⁵ PLS لكل 300 µL من PBS لنقل PLS تكيفياً إلى مستقبلات LG six الساذجة.

يتم حقن 300 µL من pulsed pls داخل الصفاق لكل حيوان. يجب تهيئة الضفادع قبل ثلاثة أيام على الأقل من تجارب طعم الجلد أو تحدي الورم، والتي سيتم عرضها لاحقاً. يتم الحصول على الجلد المخصص للتطعيم من ضفدع مانح من سلالة LG 15 تحت التخدير.

استخدم المقص لقص وإزالة قطعة صغيرة من الجلد البطني، وهو جلد البطن الذي يظهر بلون فضي. ونظرًا لوجود أربع خلايا صبغية ARI أثناء التعامل مع الطعم، فمن الضروري تقليل التعامل مع الأنسجة قدر الإمكان لأن ذلك سيؤدي إلى تلف الطعم.

أمسك الجلد برفق شديد باستخدام الملقط وضعه في طبق بتري يحتوي على PBS بارد. أبقِ طبق بتري على الجليد. ضع الجلد على شريحة زجاجية نظيفة واستخدم شفرة حلاقة لقص الطعوم الفردية إلى قطع بحجم 5 mm في 5 mm.

احتفظ بالقطع في محلول PBS على الثلج لزراعة الجلد على ضفدع المستقبل من سلالة LG six. أولاً، قم بعمل شق صغير في الجلد الظهري للضفدع المستقبل المخدر. ثم أدخل الرقعة التي يبلغ قياسها 5 mm × 5 mm تحت الجلد بحيث يكون الجانب الفضي للأعلى.

تأكد من تدوين علامات المقص والملقط على الطعوم لأنها لا تُحتسب كرفض للطعم. وبمجرد بدء التقييم بعد 24 ساعة، يجب إزالة جزء من جلد المضيف الذي يغطي الطعم. استخدم المقص لقص نافذة حول الطعم حتى يمكن رؤية الطعم بوضوح.

احذر من لمس الجلد المانح أو التسبب في حدوث نزيف. ابدأ في تحديد مخطط الرقعة على الفور عن طريق رسم تخطيطي. رقعة جلدية.

يتم تحديد الرفض من خلال نسبة تدمير الـ aridol على الجلد المطعّم. يجب فحص الطعم كل يومين إلى ثلاثة أيام تحت المجهر الستيريو. يتم تحضير الخلايا الورمية للزرع عن طريق تعليقها في وسط استزراع الخلايا الورمية بكثافة 5 × 10⁵ خلية لكل 300 µL.

قم بنقل الخلايا عن طريق الحقن تحت الجلد في أحد جانبي الجهة الظهرية للحيوان. يتم حقن 5 × 10⁵ خلية في حجم 300 µL لكل ضفدع. سيبدأ نمو الورم في غضون أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع بعد تحفيز تكوين الورم.

لاحظ المظهر الأولي للورم. استخدم الفرجار لقياس أبعاد الورم وسجل حجمه كل يومين إلى ثلاثة أيام قبل جمع كريات الدم البيضاء من الضفدع. قم بتجهيز الإبر الزجاجية عن طريق سحب أنابيب الباستا بيبيس (pasta peppes) فوق لهب.

بعد شحذ الطرف الدقيق للماصة تحت المجهر المجسم، قم بتوصيل الماصة بأنبوب شفط بلاستيكي. لبدء عملية جمع الدم، قم بعمل شق في الجلد فوق القدم الخلفية للضفدع المخدر لكشف الوريد الرصغي الظهري. املأ الإبرة الزجاجية من واحد إلى اثنين مليليتر من محلول A PBS مضافاً إليه الهيبارين المبرد بالثلج.

بعد ذلك، أدخل الإبرة الزجاجية في الوريد وابدأ في جمع الدم عن طريق الشفط البطيء باستخدام الفم. يمكن الحصول على 1 إلى 2 ملليلتر من الدم من ضفدع واحد متوسط الحجم. لا يحتاج الشق الصغير في ساق الضفدع إلى خياطة.

سوف يلتئم الجرح في غضون أسبوع. تظهر هنا نتائج تحليل بالمجهر الاستريو لرفض الطعم الجلدي بعد 12 يوماً من الزرع. لم يظهر أي رفض في ضفدع LG six مستنسخ تلقى طعماً جلدياً من متبرع LG six متطابق من حيث معقد التوافق النسيجي الكبير (MHC).

تشير النجمة إلى ملقط علامة ليس ناتجاً عن الرفض. في المقابل، يظهر ضفدع مستنسخ من سلالة LG six تلقى طعماً جلدياً من مانح غير قريب من حيث معقد التوافق النسيجي الكبير (MHC) رفضاً بنسبة 80%. وفي كلتا الصورتين، تشير الأسهم إلى خلايا صبغية فضية اللون تميز الأنسجة المطعمة السليمة غير المرفوضة.

في التجربة التالية، تم تحفيز خلايا LG 15 إما باستخدام PBS كضابط سلبي، أو بروتين GP 96 مأشوب منقى من مزرعة e coli، أو بروتين GP 96 منقى من خلايا نسيج ورم 15 zero؛ ثم نُقلت هذه الخلايا تكيفياً إلى مستقبلين بالغين من LG 15، وبعد ثلاثة أيام، زُرعت خلايا ورم 15 zero حية عن طريق الحقن تحت الجلد. تمت مراقبة الأورام التي ظهرت لأول مرة بعد عدة أيام من التحدي، وقِيس حجم الورم بشكل دوري. في هذه الرسوم البيانية، يمثل كل منحنى حركية نمو الورم في ضفدع واحد. وتظهر النتائج أن الحيوانات التي تم تحفيزها إما بـ 0.5 أو 1 µg من GP 96 شهدت تأخراً ملحوظاً في ظهور الورم مقارنة بمجموعات الضبط. وبناءً على ذلك، فإن GP 96 يسهل العرض المتقاطع لمستضدات الورم في xenopus.

لقد استعرضنا للتو كيفية استكشاف قدرة GP 96 على تمثيل كل من المستضدات الثانوية والمستضدات الورمية في ضفدع xap lavis من خلال اختبارات تطعيم الجلد وزراعة الأورام. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تجنب جمع غسيل الصفاق في حال تضرر وعاء دموي، لأن غالبية الخلايا ستكون كريات دم حمراء وليست خلايا بلعمية. كما أنه من المهم تجنب الضغط على الأنسجة باستخدام الملقط عند التعامل مع طعم الجلد لتفادي إلحاق الضرر به.

هذا كل شيء. شكراً لكم على عملية الغسل، وبالتوفيق في تجاربكم.