مقارن في الجسم الحي دراسة gp96 Adjuvanticity في الضفدع القيطم المورق

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة قدرة الحفظ التطورية لبروتين الصدمة الحرارية G 96 لتعزيز استجابات الخلايا التائية المضغوطة الثمانية الخاصة بالمستضد في أكمام الضفدع. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد الكريات البيض البريتونية أولا عن طريق الغسيل البريتوني. الخطوة الثانية من الإجراء هي نبض الكريات البيض البريتونية مع الورم المشتق GP 96 الذي يرافق المستضدات الثانوية والورم بعد الحضانة والغسيل.

يتم نقل الكريات البيض البريتونية بالتبني عن طريق الحقن داخل الصفاق إلى الضفادع الساذجة من أجل تجهيز هذه الضفادع ضد الورم أو مستضدات التوافق النسيجي البسيطة. الخطوة الثالثة من الإجراء هي إما ترقيع الجلد أو تحدي الورم للضفادع المعدة ومراقبة ظهور ترقيع الجلد أو الرفض أو ظهور الورم. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي الحصول على دم محيطي لتوصيف الخلايا التائية المشاركة في رفض الجلد والاستجابات المضادة للأورام.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر تسارعا كبيرا في رفض ترقيع الجلد ، بالإضافة إلى تأخير في ظهور الورم في الضفادع المعدة GP 96 من خلال تطعيم الجلد وفحوصات تحدي الورم على التوالي. مرحبا ، أنا كريستينا كوسكا في مختبر الدكتور جاك روبرت في قسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة في المركز الطبي بجامعة روتشستر. أنا تانيا كروز أيضا من مختبر الدكتور ريفر.

سنعرض لك اليوم إجراء لتحضير الضفادع المستنسخة عن طريق النقل بالتبني للكريات البيض البريتونية ، متبوعا بتطعيم الجلد وفحوصات زرع الورم. بالإضافة إلى ذلك ، سنوضح لك أيضا كيفية الحصول على الدم المحيطي من هذه. نستخدم هذا الإجراء في كتابنا لدراسة قدرة تسخين البروتين الخاص بك GP 96 لتعزيز خلايا CDAT الخاصة بالمستضد في Salla وكذلك لدراسة أنواع الخلايا المعنية.

حسنا ، فلنبدأ. الضفادع المستخدمة في تجاربنا هي استنساخ جيني ISO من مستعمرة التكاثر لدينا في جامعة روتشستر. لاستنباط الكريات البيض البريتونية أو الثابتة والمتنقلة للحصاد ، استخدم إبرة قياس 25 خمسة ثمانية لحقن الضفدع المخدر داخل الصفاق مع تحضير القولونية المقتول بالحرارة بعد ثلاثة أيام من الحقن الثابتة والمتنقلة يتم حصادها عن طريق الغسيل داخل الصفاق.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتطهير بطن الضفدع المخدر بكمية صغيرة من 70٪ من الإيثانول. ثم استخدم إبرة قياس 18 1.5 لحقن خمسة ملليلتر من محلول ملحي معقم من فوسفات البرمائيات المعقم ، أو PBS قبل الحرب في درجة حرارة الغرفة في التجويف البريتوني. قم بإزالة الإبرة وقم بتدليك الضفدع برفق لمدة دقيقة للتأكد من أن المخزن المؤقت المحقون يساوي السائل الموجود في تجويف الجسم.

بعد ذلك ، أدخل إبرة جديدة عيار 18 1.5 بدون حقنة في بطن الضفدع. أثناء تجنب الأوعية الدموية ، اجمع السائل البريتوني الذي سيقطر من الجزء الخلفي من الإبرة إلى أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 مل. تأكد من استرداد أكبر قدر ممكن من الحجم المحقون الأولي بعد حصاد الثابتة والمتنقلة.

ضع الضفدع في وعاء به ماء ضحل حتى يستيقظ ، وعند هذه النقطة يمكن إعادته إلى قفصه. بمجرد حصاد الثابتة والمتنقلة ، جهاز الطرد المركزي عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، قم بإزالة sups ، natant و resus. تعليق الثابتة والمتنقلة في برنامج تلفزيوني بارد.

انقل الثابتة والمتنقلة المعلقة إلى أنبوب نفايات صغير سعة 1.5 ملليلتر. لنبض الرجاء مع GP 96. أضف الكمية المناسبة من GP 96 إلى الثابتة والمتنقلة واخلطها عن طريق ماصة ، واحتضن على الجليد لمدة ساعة واحدة بعد ساعة واحدة.

الطرد المركزي للخلايا عند 14 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة. لإزالة أي GP 96 غير مرتبط ، قم بإزالة المادة الطافية. أضف البارد A PBS و resus.

قم بتعليق جهاز الطرد المركزي PLS مرة أخرى. اغسل S ب A-P-B-S-A البارد لمدة ثلاث مرات للتأكد من عدم وجود بقايا G 96 بعد الغسيل النهائي. يقوم Resus بتعليق الثابتة والمتنقلة النبضية بتركيز خمسة في 10 إلى خمسة pls لكل 300 ميكرولتر من PBS لنقل الثابتة والمتنقلة بالتبني إلى ستة مستلمين ساذجين من LG.

حقن داخل الصفاق 300 ميكرولتر من الثابتة والمتنقلة النبضية لكل. يجب تحضير الضفادع قبل ثلاثة أيام على الأقل من تجارب ترقيع الجلد أو تحدي الورم ، والتي سيتم عرضها بعد ذلك. يتم الحصول على الجلد المراد التطعيم من ضفدع متبرع مخدر من LG 15.

استخدم المقص لقص وإزالة قطعة صغيرة من الجلد البطني ، وهي جلد البطن الذي يبدو فضيا. بسبب وجود أربع خلايا مصطبغة ARI أثناء التعامل مع الكسب غير المشروع. من الأهمية بمكان أن يكون لديك أقل قدر ممكن من التلاعب بالأنسجة لأن ذلك سيؤدي إلى تلف الكسب غير المشروع.

امسك الجلد برفق شديد بالملقط وضعه في طبق بتري يحتوي على A PBS البارد. احتفظ بطبق بتري. ضع الجلد على شريحة زجاجية جديدة واستخدم ماكينة حلاقة لتقطيع الطعوم الفردية إلى قطع خمسة ملليمترات في خمسة ملليمترات.

احتفظ بالشظايا في PBS على الجليد لتطعيم الجلد على الضفدع المتلقي من LG six. أولا ، قم بعمل شق صغير على الجلد الظهري للمتلقي المخدر. ثم أدخل الكسب غير المشروع المكون من خمسة ملليمترات في خمسة ملليمترات تحت الجلد مع الجانب الفضي لأعلى.

تأكد من ملاحظة علامات المقص والملقط على الطعوم لأنها لا تحسب على أنها رفض للكسب غير المشروع. بمجرد أن يبدأ التسجيل بعد 24 ساعة ، يجب إزالة جزء من جلد المضيف المتراكب من الكسب غير المشروع. استخدم المقص لقطع نافذة حول الكسب غير المشروع بحيث يمكن تصور الكسب غير المشروع بحرية.

احرص على عدم لمس جلد المتبرع أو التسبب في نزيف. ابدأ في تسجيل الكسب غير المشروع على الفور عن طريق أخذ رسم. ترقيع الجلد.

يتم تحديد الرفض من خلال النسبة المئوية لتدمير الأريدول على الجلد المطعم. يجب فحص الكسب غير المشروع كل يومين إلى ثلاثة أيام تحت المجهر الاستريو. تحضير الخلايا السرطانية للزرع عن طريق الإعادة ، وتعليقها في وسط ثقافة الورم بكثافة خمسة في 10 إلى خمس خلايا لكل 300 ميكرولتر.

زرع الخلايا عن طريق الحقن تحت الجلد على جانب واحد من الجانب الظهري للحيوان. يتم حقن خمس مرات 10 إلى الخلايا الخمس في حجم 300 ميكرولتر لكل ضفدع. سيبدأ نمو الورم في غضون أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع بعد تحدي الورم.

لاحظ المظهر الأولي للورم. استخدم الفرجار لقياس أبعاد الورم وتسجيل حجمه كل يومين إلى ثلاثة أيام قبل جمع كريات الدم البيضاء من الضفدع. تحضير الإبر الزجاجية عن طريق سحب المعكرونة فوق اللهب.

بعد شحذ الطرف الدقيق للماصة تحت المجهر المجسم، قم بتوصيل الماصة بأنبوب بلاستيكي للشفط. لبدء جمع الدم ، قم بقطع الجلد فوق القدم الخلفية للضفدع المخدر لفضح الوريد الظهري. املأ الإبرة الزجاجية بواحد إلى ملليلترين من محلول الهيبارين المثلج A PBS plus.

ثم أدخل الإبرة الزجاجية في الوريد وابدأ في جمع الدم عن طريق الشفط ببطء بالفم. يمكن الحصول على مل إلى ملليلتر من الدم من ضفدع واحد متوسط الحجم. لا يحتاج الشق الصغير على ساق الضفدع إلى الخياطة.

سوف يلتئم الجرح في غضون أسبوع. تظهر هنا نتائج التحليل المجهري الاستريو لرفض ترقيع الجلد بعد 12 يوما من الزرع. لم يظهر ضفدع LG ستة مستنسخ تلقى طعما جلديا من متبرع مماثل ل LG six من معقد التوافق النسيجي الكبير لم يظهر أي رفض.

العلامة النجمية إلى ملقط العلامة ليس بسبب الرفض. في المقابل ، يظهر ضفدع LG المستنسخ ستة من LG والذي تلقى طعما جلديا من متبرع متباين من معقد التوافق النسيجي الكبير رفضا بنسبة 80٪. في كلتا الصورتين ، تشير الأسهم إلى أربع خلايا مصطبغة فضية تشير إلى الأنسجة المطعمة السليمة غير المرفوضة.

في هذه التجربة التالية ، تم نبض LG 15 pls إما باستخدام PBS كتحكم سلبي مؤتلف GP 96 منقى من ثقافة الإشريكية القولونية أو GP 96 المنقى من 15 خلية من خلايا الأنسجة السرطانية الصفرية ثم تم نقلها بالتبني إلى LG 15 متلقي بالغ وبعد ثلاثة أيام تم زرع 15 خلية سرطانية حية عن طريق أورام الحقن تحت الجلد التي ظهرت لأول مرة بعد أيام من مراقبة التحدي وتم قياس حجم الورم بشكل دوري في هذه الرسوم البيانية ، يمثل كل منحنى حركية نمو الورم في ضفدع واحد. تظهر النتائج أن التي تم إعدادها إما ب 0.5 أو ميكروغرام واحد من GP 96 قد أخرت بشكل كبير في ظهور الورم مقارنة بالمجموعات الضابطة. لذلك ، يسهل GP 96 العرض المتبادل لمستضدات الورم في xenopus.

لذلك أوضحنا لك للتو كيفية استكشاف قدرة GP 96 على تمثيل كل من المستضدات الثانوية والورمية في lavis xap الضفدع عن طريق تطعيم الجلد وفحوصات زرع الورم. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تجنب جمع الغسيل البريتوني في حالة تلف الأوعية الدموية لأن غالبية الخلايا داخل كريات الدم الحمراء وليس الضامة. من المهم أيضا تجنب الضغط على الأنسجة بالملقط عند التلاعب بطعم الجلد لتجنب التلف.

هذا كل شيء. شكرا على الغسيل ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.