DNA - النظائر المستقرة جس (DNA - SIP)

الهدف العام من هذا الإجراء هو استرداد الحمض النووي من الكائنات الحية الدقيقة النشطة التي استهلكت ركيزة نمو ذات أهمية دون الشرط الأساسي للزراعة المختبرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق احتضان عينة بيئية أولا مع ركيزة مثبتة بنظائر مستقرة ذات أهمية في ظل ظروف مشابهة لتلك الموجودة في البيئة الأصلية. الخطوة الثانية من الإجراء هي استخراج الحمض النووي الكلي من هذه العينة المسماة بالنظائر

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إخضاع هذا الحمض النووي لجهاز الطرد المركزي الفائق المتدرج للكثافة في كلوريد السيزيوم. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في تجزئة تدرج الكثافة للحصول على الحمض النووي الثقيل والخفيف للتوصيف الجزيئي اللاحق. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تكشف عن هوية الكائنات الحية الدقيقة النشطة وغير المزروعة المشاركة في عملية التمثيل الغذائي لركيزة معينة من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات الجزيئية الممكنة ، بما في ذلك بصمات الأصابع ، والمصفوفة الدقيقة ، والتهجين ، والاستنساخ ، وتحليل المكتبة ، وعلم الميتاجينوم.

مرحبا ، أنا جوش نيوفيلد من قسم الأحياء بجامعة واترلو. أنا إريك دانفورد ، طالب دراسات عليا في مختبر نيوفيلد. سنعرض لك اليوم إجراء لفحص نظائر الحمض النووي ، أو رشفة الحمض النووي ، والتي أصبحت تقنية مستخدمة على نطاق واسع لربط هوية الكائنات الحية الدقيقة غير المعروفة والتي يحتمل أن تكون غير مزروعة بقدرتها على استخدام ركيزة نمو ذات أهمية.

نستخدم هذا الإجراء في مختبر نيوفيلد لدراسة عملية التمثيل الغذائي لمصادر الكربون في مجموعة متنوعة من البيئات الأرضية والمائية. سنعرض لك اليوم تطبيق ركيزة كربونية معينة 13 درجة مئوية من الجلوكوز على عينة من التربة. لكننا نعترف بأنه منذ أن تم تطوير هذه الطريقة لأول مرة من قبل مجموعة كولين ميرل في جامعة وارويك ، قام الباحثون بتنويع البروتوكول ليتم تطبيقه على مجموعة متنوعة من البيئات المختلفة وأيضا باستخدام مجموعة متنوعة من النظائر المختلفة مثل النيتروجين والأكسجين.

سنركز اليوم على الكربون ، ولكن يمكن تطبيق البروتوكول نفسه على تصميمات تجريبية مختلفة. لذلك دعونا نبدأ. قبل بدء هذا الإجراء ، قم بإعداد جميع عمليات فحص النظائر المستقرة للحمض النووي أو كواشف الحمض النووي CYP كما هو موضح في الجزء المكتوب من هذا البروتوكول.

يبدأ DNAC بحضانة العينة. تختلف ظروف الحضانة بشكل كبير اعتمادا على مجموعة متنوعة من خصائص العينة والركيزة. بمجرد تحديد ظروف الحضانة المناسبة تجريبيا ، أضف تعديل الركيزة المناسب إلى العينة البيئية.

يمكنك أيضا اختيار تضمين العناصر الغذائية التكميلية لتمكين النمو الميكروبي إذا كانت مطلوبة بناء على حضانات الاختبار. بمجرد إعداد حضانة العينة ، قم بتغطية العينة وإغلاقها ، ثم احتضان العينات البيئية التي تحتوي على ركيزة مصنفة. يتضمن المثال الموضح إضافة محلول جلوكوز مسمى الكربون 13 إلى عينة التربة.

بعد ذلك ، قم بإعداد حضانة تحكم لتكون بمثابة مقارنة لتأكيد الملصقات الظاهرة للحمض النووي التي لوحظت في الخطوات اللاحقة. قم بإعداد هذه العينة في ظل ظروف متطابقة باستثناء استخدام الكربون غير المسمى كغطاء ركيزة ، وختم واحتضان العينة البيئية بركيزة غير مصنفة في نفس الظروف بعد مستخلص الحضانة ، والحمض النووي من العوالم المصغرة باستخدام بروتوكول استخراج مناسب للتطبيقات النهائية المرغوبة. ثم حدد كمية الحمض النووي المستخرج لخطوات الطرد المركزي الفائقة التالية باستخدام هلام aous ومقياس الطيف الضوئي.

استخدم الدوارات الرأسية أو القريبة من الرأسية للطرد المركزي الفائق لضمان أقصى فصل ممكن للحمض النووي الخفيف والثقيل. يحتوي الدوار Beckman Coulter VTI 65.2 على 16 بئرا لحمل أنابيب بوليمر سريعة الختم سعة 5.1 مليلتر لإعداد عينات للطرد المركزي الفائق. أولا ، احسب حجم الحمض النووي المستخرج المطلوب لإضافة 0.5 إلى خمسة ميكروغرامات من الحمض النووي إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الفائقة.

باستخدام تركيزات الحمض النووي المحددة مسبقا. ثم حدد الكثافة الدقيقة لمحلول مخزون كلوريد السيزيوم باستخدام مقياس الانكسار الرقمي. كما هو مقترح في البروتوكول المكتوب ، احسب حجم محلول الحمض النووي العازل المتدرج المطلوب لتوليد نسبة خلط مناسبة.

باستخدام هذه الحسابات ، اجمع بين الحمض النووي المستخرج مع المخزن المؤقت المتدرج و 4.8 مل من كلوريد السيزيوم في أنبوب معقم سعة 15 ملليلترا. سيكون الحجم الناتج أكبر من السعة المحددة لأنابيب الطرد المركزي من أجل ملء الأنابيب بالكامل. أخيرا يجعل الحل عن طريق عكس الأنبوب 10 مرات الاختلافات في هذا البروتوكول.

استخدم قوة نباتية مثل ahy و bromide داخل محلول التدرج لتمكين تصور الحمض النووي داخل الأنبوب. يعد تغيير كثافة الحمض النووي عند تحضيره باستخدام الحمض النووي للزراعة النقية ، بما في ذلك تدرج بروميد AUM كما هو موضح هنا ، مفيدا بشكل خاص لتوفير تأكيد بصري فوري لتكوين التدرج بعد كل جهاز طرد مركزي. يتم وصف خطوات التشغيل في استخدام مثل هذا النهج في البروتوكول المكتوب.

لإعداد الطرد المركزي الفائق أولا، استخدم لمبة ومرر ماصة لملء أنابيب الطرد المركزي الفائق بعناية بمحاليل التدرج. قم بتسمية الأنابيب الموجودة على كتف الأنبوب بقلم تحديد دائم دقيق. تأكد من أن الأنابيب مملوءة بالضبط حتى قاعدة عنق الأنبوب لأن الأنابيب غير المملوءة بشكل كاف تميل إلى الانفجار أثناء الطرد المركزي الفائق.

بمجرد ملء جميع الأنابيب المطلوبة بمحاليل العينة ، قم بتسجيل الكتلة الدقيقة لكل أنبوب من أنابيب الفرز كأزواج متطابقة بشكل وثيق وأضف أو أزل الكميات الجديدة من المحلول حتى يتم موازنتها في حدود 10 ملليغرام. حافظ على مستوى المحلول بالقرب من قاعدة الأنبوب بعد ذلك قدر الإمكان. ثم أغلق الأنابيب باستخدام غطاء الأنبوب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

تأكد من إغلاق الأنابيب بشكل صحيح عن طريق قلبها والضغط المعتدل. قم بوزن الأنابيب مرة أخرى للتأكد من أنها لا تزال متوازنة بعد إغلاقها قبل الطرد المركزي الفائق. افحص كل دوار بعناية للتأكد من أنه نظيف وخلوي من أي غبار وحطام يمكن أن يثقب الأنابيب أثناء الطرد المركزي الفائق.

أدخل الأنابيب في الدوار ، مع وضع الأزواج المتوازنة مقابل بعضها البعض. سجل موقع الدوار لكل عينة حيث يمكن لعملية الطرد المركزي الفائق أن تجعل ملصقات العلامات مقروءة. أغلق الآبار الدوارة بعناية كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.

بمجرد إغلاق الآبار الدوارة ، قم بتحميل الدوار في جهاز الطرد المركزي الفائق. أغلق باب جهاز الطرد المركزي الفائق وقم بتطبيق مكنسة كهربائية للدوار VTI 65.2. اضبط سرعة الدوران على 44 ، 100 دورة في الدقيقة ، ودرجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية ووقت الطرد المركزي الفائق إلى 36 إلى 40 ساعة.

تأكد من تشغيل المكنسة الكهربائية ، وحدد أقصى تسارع وقم بإيقاف تشغيل الفرامل لضمان عدم تعطل التدرج بسبب التباطؤ. مباشرة بعد الطرد المركزي الفائق ، قم بإزالة الدوار بعناية. احرص على عدم إمالة الدوار أو ارتدامه لتجنب إزعاج التدرجات داخل الأنابيب.

أخيرا ، قم بإزالة الأنابيب برفق لتجزئة التدرج. يمكن استخراج الحمض النووي من أنابيب الطرد المركزي الفائق باستخدام تقنية التجزئة. للبدء ، املأ حقنة معقمة سعة 60 ملليلتر بالماء المقطر والمقطر المنظوف الأيونات الذي يحتوي على صبغة زرقاء كافية من البروبوفول.

لتوفير لون أزرق غامق ، ضع المحقنة على ذراع تحميل مضخة المحقنة. ثم قم بتوصيل أنبوب المضخة المزود بإبرة قياس 23 بوصة واحدة وقم بتشغيل المضخة حتى يأتي بعض الماء من خلال نهاية الإبرة. تجنب أي فقاعات هواء في إمدادات المياه لأنها ستؤثر سلبا على عملية التجزئة.

لكل عينة ، قم بإعداد 12 أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مليلتر مع ملصقات تشير إلى رقم العينة والكسر. بعد ذلك ، قم بتثبيت أحد أنابيب الطرد المركزي الفائق في حامل المشبك بحركة سريعة ومضبوطة. اخترق الجزء السفلي من الأنبوب على طول خط التماس الأنبوب باستخدام إبرة جديدة قياس 23 بوصة واحدة وقم بتدوير الإبرة لضمان تشكيل ثقب موحد.

قد تجد أن قفازات اللاتكس توفر قبضة أفضل على عمود الإبرة من قفازات النتريل. باستخدام الإبرة المتصلة بأنبوب المضخة ، اخترق الجزء العلوي من الأنبوب على كتف الأنبوب العلوي على طول خط التماس بطريقة سريعة ومضبوطة. لاحظ أنه يمكن أيضا اختراق الجزء العلوي من الأنبوب متبوعا بالجزء السفلي من الأنبوب.

أيضا أن كمية صغيرة من الزيت المعدني التي تغطي كتف الأنبوب يمكن أن تساعد في منع التسرب من ختم غير صحيح حول الإبرة العلوية بمعدل مضخة معاير مسبقا. قم بضخ الماء المصبوغ في الجزء العلوي من الأنبوب للحصول على 12 425 ميكرولتر في 12 دقيقة. استخدم مؤقتا لتجميع محلول التدرج في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المسماة.

أخيرا ، تحقق من كثافة جميع الكسور لعينة واحدة على الأقل أو تدرج تحكم. باستخدام مقياس الانكسار الرقمي. توقع قيما تتراوح بين 1.690 و 1.760 جرام لكل مليلتر بكثافة متوسطة تبلغ حوالي 1.725 جرام لكل مليلتر لترسيب الحمض النووي من جميع الكسور.

أولا ، أضف 20 ميكروغراما من بولي أكريلاميد الخطي كناقل لهطول الأمطار واخلطه عن طريق الانعكاس. ثم أضف مجلدين من محلول PEG ومرة أخرى ، امزجها عن طريق الانعكاس. اترك الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين للسماح للحمض النووي بالترسب بعد الحضانة.

وضع العينات في جهاز طرد مركزي دقيق مع توجيه الأنابيب في نفس الاتجاه لضمان توطين متسق لجهاز الطرد المركزي للبيليه. قامت الأنابيب عند 13 ، 000 جم لمدة 30 دقيقة بعد الطرد المركزي باستعادة العينات من جهاز الطرد المركزي الصغير ، ثم استنشق بعناية والتخلص من التطبيق الخافض. يجب أن تكون الحبيبات مرئية في هذه المرحلة بمساعدة مصدر ضوء ساطع.

اغسل الحبيبات ب 500 ميكرولتر من 70٪ إيثانول بعد غسل جهاز الطرد المركزي للبيليه. تقوم العينات عند 13 ، 000 جم لمدة 10 دقائق بعد الطرد المركزي بشفط السوبر بعناية والتخلص منها. ستكون الحبيبات أكثر وضوحا الآن ، لكنها ستنفصل عن جدار الأنبوب بسهولة أكبر.

اترك الحبيبات تجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بمجرد أن تجف الكريات, كل حبيبات في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE. أخيرا ، قم بتشغيل خمسة ميكرولترات من كل جزء على هلام aeros لتوصيف الكسور المتدرجة باستخدام الطرق التي تمت مناقشتها في البروتوكول المكتوب.

ستظهر نتائج SIP النموذجية للحمض النووي فصل الحمض النووي المسمى وغير المسمى في شكل متدرج عن طريق الطرد المركزي الفائق. من الناحية المثالية ، سيكون هناك دقة كاملة للمادة الوراثية ذات الوزن الجزيئي العالي مثل الكربون 13 والنيتروجين 15 من المواد غير المسماة على وجه الخصوص ، وبصمات الأصابع الفريدة القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل المرتبطة بالكسور من أربعة إلى ثمانية من عينات النظائر المستقرة المحتضنة ، ولكن ليس مع الركيزة الأصلية. توفر الضوابط المحتضنة دليلا قويا يربط كائنات حية معينة بعملية التمثيل الغذائي لركيزة معينة مصنفة عند إجراؤها على الحمض النووي من ثقافتين نقيتين ، الكربون 13 المسمى حمام سلالة التهاب الميثيل المغطى بالميثيل وعدم المسمى Sian medi A TCC 10 21 ، المسمى بالحمض النووي الجيني غير المسمى ، منفصل إلى كسور متدرجة محترمة ذات كثافة مختلفة.

في هذا المثال ، يمكن ملاحظة الحمض النووي المسمى بالنظائر الثقيلة في الكسور من أربعة إلى خمسة ، بينما يوجد الحمض النووي غير المسمى بتركيزات عالية في الكسور من تسعة إلى 10. تم تشغيل الحمض النووي المضخم PCR من نفس الكسور باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام المتدرج والتدرج أو DGGE وولدت أنماط نطاقات منفصلة تتوافق مع الكائنين الحيين المدرجين في التدرج. تتراوح كثافة الكسور من 1.580 إلى 1.759 جرام لكل مليلتر تقريبا، وتظهر بالترتيب لتقليل الكثافة من اليسار إلى اليمين.

على العكس من ذلك ، قد يكون من الصعب تفسير فصل النظائر وحضانات العينات البيئية. تم احتضان تربة التندرا من خليج حازم بكندا إما بالكربون 12 أو الكربون 13 المسمى الجلوكوز لمدة 14 يوما عند 15 درجة مئوية. كشفت المواد الهلامية للجزء المتدرج المنقى عن الحمض النووي الجيني لطاخة الحمض النووي عبر الجزء من سبعة إلى 10 لكل من حضانات الكربون 12 والكربون 13.

ومع ذلك ، عندما تم استخدام DGGE لجينات الحمض النووي الريبي الريبوزومي 16 ثانية لتحديد تخصيب الكربون 13 للكتلة الحيوية من أصناف ميكروبية معينة ، التربة المحتضنة للجلوكوز الكربوني 12 ، أنتج الحمض النووي أنماطا متشابهة عبر جميع الكسور المتدرجة بينما أنتجت عينة الجلوكوز المحتضنة من الكربون 13 بصمات DGG التي ترتبط بشكل فريد بالكسور من خمسة إلى ثمانية ، تمثل النطاقات المحفوظة المشار إليها بواسطة الأسهم نوع الشعبة السائد المتسق عبر جميع الكسور المتدرجة. ينتقل نوع phylo إلى أجزاء أثقل للحمض النووي الذي تم الحصول عليه من التربة المحتضنة الجلوكوز الكربوني 13. يمكن تحديد هوية جين الحمض النووي الريبي الريبوزومي 16 ثانية لتوجيه الأساليب الميتاجينومية أو القائمة على الزراعة اللاحقة.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء تجربة فحص النظائر المستقرة للحمض النووي من احتضان العينات إلى الحصول على الحمض النووي المسمى للتحليل الجزيئي. عند تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تفكر في تصميمك التجريبي بعناية ، وكن حذرا لتجنب إضافة الكثير من الركيزة لتجنب تحيز تجربتك نحو الكائنات الحية سريعة النمو. تريد أيضا تجنب الحضانة الممتدة حتى لا تضعف الركيزة لأعضاء آخرين في المجتمع من خلال شبكة غذائية.

لذلك تريد استخدام الكمية المناسبة من الركيزة وأوقات الحضانة الكافية فقط للسماح لك باكتشاف كمية صغيرة من الحمض النووي المسمى في الكسور الثقيلة ذات التطبيقات الحساسة القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.