DNA - النظائر المستقرة جس (DNA - SIP)

الهدف العام من هذا الإجراء هو استعادة DNA من الكائنات الحية الدقيقة النشطة التي استهلكت ركيزة نمو معينة دون الحاجة المسبقة للزراعة المختبرية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضين عينة بيئية مع ركيزة معينة موسومة بنظير مستقر في ظل ظروف مشابهة لتلك الموجودة في البيئة الأصلية. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في استخلاص DNA الكلي من هذه العينة الموسومة بالنظير.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إخضاع هذا الـ DNA لعملية الطرد المركزي الفائق بتدرج الكثافة في كلوريد السيزيوم. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي تجزئة تدرج الكثافة للحصول على الـ DNA الثقيل والخفيف من أجل التوصيف الجزيئي اللاحق. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تكشف عن هوية الكائنات الدقيقة النشطة وغير المستزرعة المشاركة في استقلاب ركيزة معينة من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات الجزيئية الممكنة، بما في ذلك البصمة الوراثية، والمصفوفات الدقيقة، والتهجين، وتحليل المستنسخات والمكتبات، والميتاجينوميات.

مرحباً، أنا جوش نيوفيلد من قسم الأحياء بجامعة واترلو. وأنا إيريك دنفورد، طالب دراسات عليا في مختبر نيوفيلد. سنعرض لكم اليوم إجراءً لسبر النظائر في الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين، أو DNA sip، والتي أصبحت تقنية مستخدمة على نطاق واسع لربط هوية الكائنات الحية الدقيقة المجهولة والتي قد تكون غير قابلة للاستزراع بقدرتها على استخدام ركيزة نمو معينة.

نستخدم هذا الإجراء في مختبر Newfeld لدراسة استقلاب مصادر الكربون في مجموعة متنوعة من البيئات البرية والمائية. سنعرض لكم اليوم تطبيق ركيزة كربونية محددة وهي 13 C glucose على عينة تربة. ولكننا نقر بأنه منذ تطوير هذه الطريقة لأول مرة من قبل مجموعة Colin Merle في جامعة Warwick، قام الباحثون بتنويع البروتوكول ليتم تطبيقه على مجموعة متنوعة من البيئات المختلفة وأيضاً باستخدام مجموعة متنوعة من النظائر المسمومة مثل النيتروجين والأكسجين.

سنركز اليوم على الكربون، ولكن يمكن تطبيق البروتوكول نفسه على تصميمات تجريبية مختلفة. لذا، فلنبدأ. قبل البدء في هذا الإجراء، قم بتحضير جميع كواشف سبر النظائر المستقرة للحمض النووي (DNA stable isotope probing) أو كواشف DNA CYP كما هو موضح في الجزء المكتوب من هذا البروتوكول.

تبدأ عملية DNAC بحضانة العينة. وتختلف ظروف الحضانة بشكل كبير اعتماداً على مجموعة متنوعة من خصائص العينة والركيزة. وبمجرد تحديد ظروف الحضانة المناسبة تجريبياً، يتم إضافة تعديل الركيزة المناسب إلى العينة البيئية.

يمكنك أيضاً اختيار إضافة مغذيات تكميلية لتمكين النمو الميكروبي إذا كانت هذه المغذيات مطلوبة بناءً على عمليات التحضين الاختبارية. وبمجرد إعداد تحضين العينة، قم بتغطية العينة وإحكام غلقها، ثم قم بتحضين العينات البيئية التي تحتوي على الركيزة الموُسمة. يتضمن المثال المعروض إضافة محلول جلوكوز موُسم بالكربون 13 إلى عينة تربة.

بعد ذلك، قم بإعداد حضانة ضابطة لتكون بمثابة مقارنة للتأكيد على وسم الحمض النووي الظاهر والملاحظ في الخطوات اللاحقة. جهز هذه العينة تحت ظروف متطابقة باستثناء استخدام كربون غير موسوم كغطاء للركيزة، ثم أحكم إغلاق العينة البيئية واحضنها مع الركيزة غير الموسومة تحت نفس الظروف؛ وبعد انتهاء الحضانة، استخلص DNA من النظم البيئية المصغرة باستخدام بروتوكول استخلاص مناسب للتطبيقات اللاحقة المطلوبة. ثم قم بقياس كمية DNA المستخلص لخطوات الطرد المركزي الفائق التالية باستخدام هلام الأغار ومطياف ضوئي.

استخدم دوارات رأسية أو شبه رأسية في جهاز الطرد المركزي الفائق لضمان تحقيق أقصى فصل ممكن بين الحمض النووي DNA الخفيف والثقيل. يحتوي الدوار Beckman Coulter VTI 65.2 على 16 بئراً لحمل أنابيب بوليمر سريعة الإغلاق بسعة 5.1 milliliter لتحضير العينات لعملية الطرد المركزي الفائق. أولاً، احسب حجم الحمض النووي DNA المستخلص المطلوب لإضافة ما بين 0.5 إلى 5 micrograms من الـ DNA إلى أنابيب جهاز الطرد المركزي الفائق.

باستخدام تركيزات DNA المحددة مسبقاً. بعد ذلك، يتم تحديد الكثافة الدقيقة للمحلول المخزون من كلوريد السيزيوم باستخدام مقياس انكسار رقمي. وكما هو مقترح في البروتوكول المكتوب، يتم حساب حجم محلول DNA في محلول منظم التدرج المطلوب لإنشاء نسبة خلط مناسبة.

باستخدام هذه الحسابات، اخلط الحمض النووي DNA المستخلص مع محلول التدرج المنظم و4.8 milliliters من كلوريد السيزيوم في أنبوب معقم مخصص للاستخدام مرة واحدة بسعة 15 milliliter. سيكون الحجم الناتج أكبر من السعة المحددة لأنابيب جهاز الطرد المركزي من أجل ملء الأنابيب بالكامل. وأخيراً، قم بتجانس المحلول عن طريق قلب الأنبوب 10 مرات وفقاً لتنويعات هذا البروتوكول.

استخدم صبغة فلورية مثل ethidium bromide ضمن محلول التدرج لتمكين رؤية الـ DNA داخل الأنبوب. إن تغيير كثافة الـ DNA عند تحضيره باستخدام DNA من مزرعة نقية، بما في ذلك تدرج ethidium bromide كما هو موضح هنا، مفيد بشكل خاص لتوفير تأكيد بصري فوري على تشكل التدرج بعد كل عملية طرد مركزي. تم وصف خطوات التنفيذ باستخدام هذا النهج في البروتوكول المكتوب.

لإعداد عملية الطرد المركزي الفائق أولاً، استخدم مصاصة ذات بصيلة ومصاصة باستور لملء أنابيب الطرد المركزي الفائق بعناية بمحاليل التدرج. ضع علامات على الأنابيب عند كتف الأنبوب باستخدام قلم تحديد دائم دقيق. تأكد من ملء الأنابيب تماماً حتى قاعدة عنق الأنبوب، حيث أن الأنابيب غير المملوءة بشكل كافٍ تكون عرضة للانفجار أثناء عملية الطرد المركزي الفائق.

بمجرد ملء جميع الأنابيب المطلوبة بمحاليل العينات، سجل الكتلة الدقيقة لكل أنبوب، ثم رتب الأنابيب في أزواج متطابقة قدر الإمكان، وأضف أو أزل كميات ضئيلة من المحلول حتى يتم موازنتها في حدود 10 milligrams. حافظ على مستوى المحلول ليكون أقرب ما يمكن إلى قاعدة الأنبوب التالي. بعد ذلك، أحكم إغلاق الأنابيب باستخدام سدادة أنابيب وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

تحقق من إحكام غلق الأنابيب عن طريق قلبها والضغط عليها ضغطاً متوسطاً. زن الأنابيب مرة أخرى للتأكد من بقائها متوازنة بعد الإغلاق وقبل البدء في عملية الطرد المركزي الفائق. افحص كل تجويف في الدوار بعناية لضمان نظافته وخلوه من أي غبار أو شوائب قد تؤدي إلى ثقب الأنابيب أثناء عملية الطرد المركزي الفائق.

أدخل الأنابيب في الدوار، مع وضع الأزواج المتوازنة في مواجهة بعضها البعض. سجل موقع كل عينة في الدوار لأن عملية الطرد المركزي الفائق قد تجعل ملصقات العلامات غير مقروءة. أغلق آبار الدوار بعناية كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة.

بمجرد إغلاق آبار الدوار بإحكام، قم بتحميل الدوار في جهاز الطرد المركزي الفائق. أغلق باب جهاز الطرد المركزي الفائق وقم بتفريغ الهواء من أجل الدوار VTI 65.2. اضبط سرعة الدوران على 44,100 RPM ودرجة الحرارة على 20 °C ومدة الطرد المركزي الفائق من 36 إلى 40 ساعة.

تأكد من تشغيل المكنسة الكهربائية (vacuum)، واختر أقصى تسارع، وقم بإيقاف تشغيل المكابح لضمان عدم تعطل التدرج بسبب التباطؤ. قم بإزالة الدوار بعناية فور الانتهاء من عملية الطرد المركزي الفائق. احذر من إمالة الدوار أو اصطدامه لتجنب إخلال التدرجات داخل الأنابيب.

أخيرًا، قم بإزالة الأنابيب برفق لإجراء التجزئة المتدرجة. يمكن استخلاص الـ DNA من أنابيب جهاز الطرد المركزي الفائق باستخدام تقنية التجزئة. للبدء، املأ محقنة معقمة سعة 60 milliliter بماء مقطر ومنزوع الأيونات ومعقم يحتوي على كمية كافية من صبغة propofol blue.

للحصول على لون أزرق داكن، ضع المحقنة على ذراع التحميل الخاص بمضخة المحاقن. ثم قم بتوصيل أنابيب المضخة المزودة بإبرة مقاس 23 عيار وبطول بوصة واحدة، وقم بتشغيل المضخة حتى يبدأ الماء بالخروج من طرف الإبرة. تجنب وجود أي فقاعات هواء في إمدادات الماء لأنها ستؤثر سلبًا على عملية التجزئة.

لكل عينة، قم بتحضير 12 أنبوب طرد مركزي دقيق معقماً سعة 1.5 milliliter مع وضع ملصقات توضح رقم العينة والكسر. بعد ذلك، قم بتثبيت أحد أنابيب الطرد المركزي الفائق في حامل مشبك بحركة سريعة ومحكومة. اثقب قاع الأنبوب على طول درزة الأنبوب باستخدام إبرة جديدة مقاس 23 gauge وطول one inch، وقم بتدوير الإبرة لضمان تكوين ثقب منتظم.

قد تجد أن القفازات المصنوعة من اللاتكس توفر تماسكاً أفضل بعمود الإبرة من القفازات المصنوعة من النتريل. باستخدام الإبرة المتصلة بأنبوب المضخة، قم بثقب الجزء العلوي من الأنبوب عند كتف الأنبوب العلوي على طول خط اللحام بطريقة سريعة ومنضبطة. لاحظ أنه يمكن أيضاً ثقب الجزء العلوي من الأنبوب يليه ثقب الجزء السفلي منه.

لاحظ أيضاً أن وضع كمية صغيرة من الزيت المعدني على كتف الأنبوب يمكن أن يساعد في منع التسريب الناتج عن عدم إحكام الغلق حول الإبرة العلوية مع معدل ضخ تمت معايرته مسبقاً. قم بضخ المياه المصبوغة في الجزء العلوي من الأنبوب للحصول على 12 جزءاً بحجم 425 microliter خلال 12 دقيقة. استخدم مؤقتاً لجمع محلول التدرج في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المحددة.

أخيرًا، تحقق من كثافة جميع الأجزاء لعينة واحدة على الأقل أو لتدرج ضابط، وذلك باستخدام مقياس انكسار رقمي. يُتوقع أن تكون القيم في النطاق من 1.690 إلى 1.760 grams per milliliter بمتوسط كثافة يبلغ حوالي 1.725 grams per milliliter لترسيب DNA من جميع الأجزاء.

أولاً، أضف 20 micrograms من poly acrylamide الخطي كحامل للترسيب وامزج عن طريق القلب. ثم أضف حجمين من محلول PEG وامزج مرة أخرى عن طريق القلب. اترك الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين للسماح بترسيب DNA بعد الحضن.

توضع العينات في جهاز طرد مركزي دقيق مع توجيه الأنابيب في نفس الاتجاه لضمان تموضع متسق للراسب الناتج عن الطرد المركزي. تُدوّر الأنابيب عند 13,000 G لمدة 30 دقيقة، وبعد انتهاء عملية الطرد المركزي تُستخرج العينات من الجهاز، ثم يُسحب الطافي ويُتخلص منه بعناية. يجب أن يكون الراسب مرئياً في هذه المرحلة بمساعدة مصدر ضوء ساطع.

اغسل الراسب بـ 500 µL من الإيثانول بتركيز 70% بعد غسل الراسب بجهاز الطرد المركزي. قم بطرد العينات مركزياً عند 13,000 G لمدة 10 دقائق، وبعد الطرد المركزي، اسحب السائل الطافي بعناية وتخلص منه. سيصبح الراسب الآن أكثر وضوحاً، ولكنه سينفصل عن جدار الأنبوب بسهولة أكبر.

اترك الراسب ليجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وبمجرد جفاف الرواسب، قم بتعليق كل راسب في 50 µL من محلول TE المنظم. وأخيراً، قم بتشغيل 5 µL من كل جزء على هلام aeros لتوصيف أجزاء التدرج باستخدام الطرق الموضحة في البروتوكول المكتوب.

ستظهر نتائج تحليل DNA SIP النموذجية انفصال الـ DNA المُعلم عن الـ DNA غير المُعلم في شكل تدرج عن طريق الطرد المركزي الفائق. ومن الناحية المثالية، سيكون هناك فصل تام للمواد الوراثية ذات الوزن الجزيئي المرتفع، مثل تلك المُعلمة بـ carbon 13 و nitrogen 15، عن المواد غير المُعلمة؛ وبشكل خاص، ستظهر بصمات فريدة قائمة على PCR مرتبطة بالأجزاء من الرابع إلى الثامن من العينات المحضنة بالنظائر المستقرة، ولكن ليس مع الركيزة الأصلية. توفر الضوابط المحضنة دليلاً قوياً يربط كائنات حية محددة بتمثيل غذائي لركيزة مُعلمة معينة عند إجرائها على DNA من مزرعتين نقيتين، وهما سلالة bath من methyl occus capsulitis المُعلمة بـ carbon 13 و Sian medi A TCC 10 21 غير المُعلمة، حيث ينفصل الـ genomic DNA المُعلم وغير المُعلم إلى أجزاء التدرج المقابلة ذات الكثافات المختلفة.

في هذا المثال، يمكن ملاحظة الحمض النووي DNA المسمى بنظير ثقيل في الكسور من الرابع إلى الخامس، بينما يوجد الحمض النووي DNA غير المسمى بتركيزات عالية في الكسور من التاسع إلى العاشر. تم تشغيل الحمض النووي DNA المضخم بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR من نفس الكسور باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام التدرج والمسخ أو DGGE، مما أدى إلى ظهور أنماط نطاقية متميزة تقابل الكائنين المضمنين في التدرج. تتراوح كثافة الكسور من 1.580 إلى 1.759 grams per milliliter تقريبًا، وهي معروضة بترتيب تناقص الكثافة من اليسار إلى اليمين.

على العكس من ذلك، قد يكون تفسير فصل النظائر وتحضينات العينات البيئية أكثر صعوبة. حيث تم تحضين تربة التندرا من ريزولوت باي بكندا مع جلوكوز مُعلم إما بالكربون 12 أو الكربون 13 لمدة 14 يوماً عند درجة حرارة 15 درجة مئوية. وقد كشفت صور الهلام الكهربائي لـ DNA من أجزاء التدرج المنقى عن وجود لطخة من DNA الجينومي عبر الأجزاء من 7 إلى 10 لكل من تحضينات الكربون 12 والكربون 13.

ومع ذلك، عند استخدام تقنية DGGE لجينات 16 s ribosomal RNA لتحديد إثراء الكربون 13 في الكتلة الحيوية لمجموعات ميكروبية معينة، أظهر الحمض النووي DNA المستخلص من التربة المحضنة بجلوكوز الكربون 12 أنماطاً مماثلة عبر جميع كسور التدرج، بينما أنتجت العينة المحضنة بجلوكوز الكربون 13 بصمات DGGE مرتبطة بشكل فريد بالكسور من الخامس إلى الثامن، ومثلت النطاقات المحفوظة التي تشير إليها الأسهم النمط الفيلوجيني السائد والمتسق عبر جميع كسور التدرج. وتنتقل الأنماط الفيلوجينية إلى الكسور الأكثر ثقلاً في حالة DNA المستخلص من التربة المحضنة بجلوكوز الكربون 13. ويمكن تحديد هوية جين 16 s ribosomal RNA هذا لتوجيه المناهج اللاحقة القائمة على الميتاجينوميات أو الاستزراع.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء تجربة سبر النظائر المستقرة للحمض النووي (DNA stable isotope probing)، بدءاً من تحضين العينات وصولاً إلى الحصول على الحمض النووي المسمى للتحليل الجزيئي. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم مراعاة تصميم تجربتكم بعناية، والحرص على عدم إضافة كمية كبيرة جداً من الركيزة لتجنب تحيز تجربتكم نحو الكائنات سريعة النمو. كما يجب تجنب فترات التحضين الممتدة حتى لا تنتقل الركيزة إلى أعضاء آخرين في المجتمع الحيوي عبر الشبكة الغذائية.

إذًا، أنت ترغب في استخدام الكمية المناسبة تمامًا من الركيزة وفترات تحضين كافية تتيح لك الكشف عن كميات صغيرة من الحمض النووي المسمى في الكسور الثقيلة باستخدام تطبيقات PCR الحساسة. هذا كل شيء. شكرًا للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.