Microdissection من الأنسجة الجنينية العين اسماك الزرد

يعرض هذا الفيديو عملية التشريح المجهري للشبكية، والشبكية مع الظهارة الصباغية الشبكية، أو RPE الملتصقة، من أجنة سمك الزيبرا في اليوم الأول إلى الثالث بعد الإخصاب. يمكن إجراء جميع الخطوات باستخدام ملاقط دقيقة ومستلزمات مختبرية عامة. وتحت المجهر الاستريو القياسي المخصص لتشريح الشبكية، يتم إزالة طبقة RPE الوحيدة وتقشيرها عن طريق حركة مسحية واعتماداً على التصاق RPE بسطح طبق الزرع.

بالنسبة لتشريح الشبكية الملتصقة بالظهارة الصباغية للشبكية (RPE)، تتم إزالة الخواص اللاصقة لطبق الزرع عن طريق السحق الجنيني والغسل قبل البدء في عملية التشريح. وللحفاظ على سلامة الظهارة الصباغية للشبكية، يتم رفع هذا النسيج بعناية مما يؤدي إلى فصل المشيمية والصلبة بكفاءة عن الشبكية الملتصقة بالظهارة الصباغية للشبكية، يليه إزالة العدسة باستخدام إبرة تنجستن محفورة كيميائياً. تتيح طريقة التشريح هذه الحصول على أنسجة شبكية سليمة، وقد استُخدمت بنجاح لدراسة تعبير RNA الخاص بالأنسجة، وملفات الشبكية والظهارة الصباغية للشبكية في سمك الزيبرا.

مرحباً، أنا لي جانج من مختبر الأستاذ يو إف إي ليون في قسم العلوم البيولوجية بجامعة بوردو. سنعرض لكم اليوم كيفية تشريح أنسجة العين الجنينية لسمكة الزيبرا. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الشبكة الجينية التي تنظم تطور العين.

فلنبدأ الآن. ثامناً، قبل البدء في التشريح المجهري، قم بتحضير المحاليل التالية: محلول Ringer المفلتر والمعقم، ومحلول هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 5 normal.

بعد ذلك، يتم إجراء نقش كيميائي للإبر التنجستنية. ضع كأساً زجاجياً صغيراً داخل طبق بتري وثبته بالصلصال لتسهيل التعامل مع الكأس ومنع انسكاب هيدروكسيد الصوديوم. ثم قم بتثبيت مشبك ورق قياسي على جانب الكأس.

صب هيدروكسيد الصوديوم العادي في الكأس حتى يلامس المشبك محلول هيدروكسيد الصوديوم. قم بتوصيل القطب السالب من مصدر طاقة تيار مستمر بالمشب الورقي، والقطب الموجب بطرف قطعة قصيرة من سلك التنجستن. غلف الطرف الآخر من سلك التنجستن بكرة طينية بقطر 4 mm واغمر هذا الطرف في محلول هيدروكسيد الصوديوم.

ارفع الجهد الكهربائي إلى ثلاثة فولت تقريبًا، ثم اغمس السلك صعودًا وهبوطًا في محلول هيدروكسيد الصوديوم بمعدل مرة واحدة في الثانية، وذلك على مدار 10 دقائق تقريبًا. سيصبح سلك التنجستن المعرض لهيدروكسيد الصوديوم أرق تدريجيًا، بينما ستتخذ كرة الصلصال التي تسقط من الجانب الآخر للسلك المتصل بالقطب الموجب شكل إبرة حادة. اشطف الإبرة الحادة بمحلول رينجر أو E3 لإزالة الرواسب الملحية، ثم ثبت الإبرة على عود تطبيقي خشبي باستخدام شريط لاصق أو حامل إبر لسهولة التحكم بها عند تحضير الأجنة للتشريح.

يتم الحفاظ على أسماك super fish البالغة وفقاً للبروتوكولات القياسية في الليلة التي تسبق عملية التزاوج. تُفصل الأسماك الأبوية في أحواض تزاوج ساكنة في أزواج باستخدام فاصل. يُزال الفاصل بعد تشغيل إضاءة الغرفة في صباح اليوم التالي، ويُسمح للأبوين بالتزاوج على فترات مدتها 10 دقائق كل نصف ساعة، مع فصل الأسماك بعد كل عملية تزاوج.

يتم الحفاظ على الأجنة التي جُمعت من كل عملية تزاوج بشكل منفصل في وسط E three عند درجة حرارة 28 درجة Celsius. يتم تحديد مرحلة الأجنة بعد 10 إلى 12 ساعة من الإخصاب، وإعادة تحديد المرحلة مباشرة قبل التشريح في النقاط الزمنية المحددة. تُستخدم أطباق زراعة بوليسترين من نوع Falcon بمقاس 60 × 15 مليمتر لعملية التشريح.

تتمتع الشرائح الجديدة غير المستخدمة بخاصية التصاق ذاتية لأنسجة الظهارة الصبغية للشبكية (RPE) لمدة تصل إلى 20 دقيقة تقريبًا، ويمكن أن تساعد في إزالة الـ RPE عند إجراء تشريحات الشبكية. أما إذا كان المطلوب هو الشبكية الملتصقة بـ RPE، فيمكن التغلب على خاصية الالتصاق هذه عن طريق سحق جنينين تمامًا في طبق زرع يحتوي على محلول رينجر وتركهما لمدة 30 دقيقة قبل التشريح، يليه غسيل مكثف بمحلول رينجر جديد قبل البدء في عملية التشريح. تُجرى جميع التشريحات الدقيقة بتكبير يتراوح بين 5 إلى 8 مرات باستخدام مجهر Olympus SC X 16 مع عدسة شيئية بقوة 1x.

باستخدام ملاقط dumont أو إبرة تنجستن محفورة كيميائياً، يتم تسخين منصة المجهر إلى 28 °C. ولتقليل تأثير تقلبات درجة الحرارة عند البدء في تشريح الشبكية، يتم نقل جنين في مرحلة نمو محددة إلى 5 mL من محلول ringer في طبق زرع Falcon مقاس 60 × 15 mm مُعد كما هو موضح في عملية تشريح الشبكية بدون RRPE، ثم يتم قطع الرأس وجزء من الجذع الأمامي باستخدام الطرف الحاد للملاقط مع إزالة جسم سمكة الزيبرا بسرعة. بعد ذلك، يتم تثبيت الطرف الخلفي لمقطع الرأس والجذع بدبابيس على طبق الزرع. وباستخدام الملاقط المساعدة، يتم فتح الرأس من الجانب الظهري بدءاً من الجبهة الأمامية.

قم بإزالة الدماغ بحيث يكون الجانب الإنسي للعينين مكشوفاً وموجهاً للأعلى لإجراء المزيد من التعاملات. ولتشريح الشبكية، استخدم طرف الملقط لفرك ظهارة صبغية الشبكية (RPE) المكشوفة بعناية على الجانب الإنسي للعين الموجه للأعلى حتى تظهر فتحة صغيرة تؤدي إلى الشبكية. استمر في عملية الفرك والتقشير حتى يتم كشف الجانب الإنسي للشبكية بالكامل تقريباً.

تجنب خدش أو ثقب الشبكية المكشوفة عند إزالة الظهارة الصبغية للشبكية (RPE) الجانبية في العين الموجهة نحو طبق الزرع. يجب أن تكون الزاوية حوالي 45 درجة من سطح طبق الزرع، مع ملامسة العين برفق باستخدام الملقط. قم بإزالة الظهارة الصبغية للشبكية (RPE) الملتصقة بإحكام نسبيًا بالمنطقة المسننة (ora serrata) عن طريق تثبيت الجزء المنفصل من الظهارة الصبغية للشبكية (RPE) على طبق الزرع لإتمام عملية التشريح.

ثم ارفع الشبكية برفق لتنظيف بقايا الظهارة الصبغية للشبكية (RPE) وإزالة العدسة باستخدام خاصية الالتصاق الخاصة بطبق الزرع. احرص على عدم إتلاف خلايا الشبكية، والتي ستلتصق هي الأخرى بشكل طفيف بسطح الطبق. إذا لم تنفصل العدسة عن طريق التدحرج، استخدم إبرة تنجستن محفورة مع تحريكها بحركة دورانية على سطح العدسة.

لبدء عملية تشريح الشبكية الملتصقة بـ RPE، استخدم طبق استزراع Falcon بمقاس 60 × 15 مليمتر مُعد كما هو موضح في عملية تشريح الشبكية الملتصقة بـ RPE. انقل جنيناً في مرحلة نمو محددة إلى 5 ملليلتر من محلول رينجر. اقطع الرأس وجزءاً من الجذع الأمامي.

إزالة جسم سمكة الزيبرفيش بسرعة كما تم القيام به سابقاً. قم بتثبيت الطرف الخلفي من قسم الجذع والرأس على طبق استنبات. وباستخدام الملاقط المساعدة، افتح الرأس من الجانب الظهري بدءاً من الجبهة الأمامية.

قم بإزالة الدماغ بحيث يكون الجانب الإنسي للعينين مكشوفاً وموجهاً للأعلى. ولإجراء المزيد من المناولات باستخدام الملاقط، ارفع العين برفق من الجانب الوحشي الخلفي وقم بتدويرها نحو الجانب الأمامي. تكون أنسجة المشيمية والصلبة الموجودة خارج طبقة الظهارة الصبغية الشبكية (RPE) مرتبطة بإحكام نسبياً بالجلد، ويمكن تقشير معظمها عن طريق تدوير العين بعناية نحو الجانب الأمامي.

قم بإزالة العدسة باستخدام إبرة التنجستن بعد كشف الجانب الجانبي للعين وبينما لا تزال العين متصلة بالجلد من أجل تشريح الشبكية. وفي غياب الظهارة الصباغية للشبكية (RPE) والشبكية المرتبطة بها، يمكن جمع العينات المشرحة في مادة triol داخل أنبوب RNA re micro مخصص للتحاليل اللاحقة لتوصيف RNA.

يظهر هنا تشريح ناجح للشبكية بدون ظهارة صبغية شبكية (RPE)، حيث تم الحفاظ على سلامة الشبكية كما يتضح من سطح الشبكية السليم. كما يظهر المقطع النسيجي المقابل أن بنية الشبكية محفوظة بشكل جيد جداً. وبوجه خاص، فإن الحفاظ على المصفوفة خارج الخلوية بين طبقة المستقبلات الضوئية والظهارة الصبغية الشبكية (RPE) جيد للغاية.

يظهر نجاح عملية تشريح الشبكية مع بقاء الظهارة الصبغية للشبكية (RPE) ملتصقة من خلال طبقة RPE السليمة والمتصلة. ويبيّن المقطع النسيجي المقابل أن كلاً من خلايا الشبكية وخلايا RPE في حالة جيدة. كما أن إجمالي الـ RNA المستخلص من الشبक्यों المشرحة ذو جودة عالية.

يظهر ذلك في مخطط الفصل الكهربائي وصورة الهلام التي تم الحصول عليها من تحليل جهاز الـ bioanalyzer. حيث يبدو خط الأساس مسطحاً وقمم الريبوسوم 18 s و 28 s سليمة. وعادةً ما يكون رقم سلامة الـ RNA أكبر من 9.8.

لقد عرضنا لكم للتو إجراءات التشريح الدقيق للحصول على شبكية جنين سمكة الزيبرا بوجود أو بدون الظهارة الصبغية الشبكية (RPE). عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن الخطوات الأكثر أهمية في تشريح الشبكية هي حركة المسح بطرف الملاقط وعملية دحرجة الأنسجة. ولإزالة بقايا الظهارة الصبغية الشبكية (RPE)، وجدنا أن وضع المرفقين على مسند الذراع القابل للتعديل في الكرسي أثناء التشريح يمكن أن يساهم بشكل كبير في استقرار حركات اليد.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.