التثقيب الكهربائي العضوي: طريقة لنقل الحمض النووي البلازميد إلى عضيات الجهاز الهضمي

- العضيات هي مزارع خلايا صغيرة ثلاثية الأبعاد مشتقة من الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة. إنها مستقرة جينومية ولكنها قابلة للتعديل وراثيا من خلال التعدي وبالتالي فهي مثالية للتحقيق الجيني. بالنسبة للتعدين ، فإن عضيات البذور في صفيحة استزراع متعددة الآبار مع وسط ثقافة محدد وتحتضن للمدة المطلوبة. بعد ذلك ، أضف خليط التفكك إلى الطبق للمساعدة في تفكك الخلايا العضوية. انقل الخليط إلى أنبوب وجهاز طرد مركزي. أعد تعليق الحبيبات العضوية في مخزن مؤقت للتثقيب الكهربائي يحتوي على الحمض النووي البلازميد المسمى بالفلورسنت. يعمل المخزن المؤقت على استقرار الخلايا ويمنع موت الخلايا بسبب الإجهاد الكهربائي.

انقل الخليط إلى كوفيت وقم بتغذية الخلايا بالكهرباء. تؤدي النبضات الكهربائية عبر غشاء الخلية إلى تكوين مسام مؤقت لتسهيل امتصاص الحمض النووي البلازميد في الخلية. بعد التثقيب الكهربائي ، أضف وسط الثقافة على الفور إلى تعليق الخلية وانقل الخليط إلى أنبوب. الآن ، قم بالطرد المركزي للخلايا. أعد تعليق الحبيبات في مصفوفة الطابق السفلي وانقلها إلى اللوحة متعددة الآبار للبلمرة. ضع اللوحة تحت مجهر الفلورسنت وتحقق من وجود مضان في الخلايا ، مما يؤكد التعداء الفعال. في البروتوكول التالي ، سنقوم بإجراء التثقيب الكهربائي لنقل عضيات الجهاز الهضمي.

- ابدأ بالتسخين المسبق للألواح المكونة من 48 بئرا عند 37 درجة مئوية للبذر بعد التثقيب الكهربائي ، ثم قم بإعداد الوسائط القاعدية والعضوية الخاصة بالثقافة وفقا لتوجيهات المخطوطة. قم بزراعة خمسة آبار من العضيات لكل عينة كهربائية في صفيحة 48 بئرا. تحضير 230 ميكرولتر من كاشف التفكك مع 10 ميكرومولار Y27632 لكل بئر. راقب العضيات تحت المجهر. قم بإزالة وسط الاستزراع من الآبار وفصل العضيات ميكانيكيا في خليط التفكك المحضر. تجمع خمسة آبار لكل عينة كهربائية في أنبوب واحد سعة 15 مل.

امزج محتويات الأنبوب عن طريق الدوامة واحتضانه لمدة 5 إلى 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية حتى تحدث مجموعات من 10 إلى 15 خلية ، والتحقق من التفكك بالمجهر. أوقف عملية الهضم عن طريق إضافة ما يصل إلى 10 مل من الوسط القاعدي بدون مضادات حيوية. الطرد المركزي الأنبوب عند 450 مرة جم لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية واغسل الخلايا مرتين باستخدام 4 مل من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي. جهاز الطرد المركزي وتخلص من المادة الطافية بعد كل غسلة. بعد الغسيل ، قم بتعليق الحبيبات العضوية في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي مع 30 ميكروغراما من الحمض النووي البلازميد.

قم بتوزيع خليط الحمض النووي العضوي الكامل في كوفيت التثقيب الكهربائي. تأكد من تجنب فقاعات الهواء. اضبط معلمات التثقيب الكهربائي كما هو موضح في المخطوطة النصية واضغط على الكوفيت بإصبع لخلط الخلايا برفق. ضع الكوفيت في حجرة الكوفيت واضغط على زر المعاوقة الموجود على المسام الكهربائي لتدوين قيمة المقاومة. اضغط على زر البدء لبدء برنامج التثقيب الكهربائي والتحكم في قيم التيارات والفولتية والطاقات المعروضة.

بعد التثقيب الكهربائي ، أضف على الفور 500 ميكرولتر من وسط المزرعة بدون مضادات حيوية إلى الخلايا واخلطها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. انقل العينة إلى أنبوب جديد سعة 15 ملليلتر واشطف الكوفيت بوسط قاعدي لتجميع الخلايا المتبقية ، ثم احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة. الطرد المركزي للخلايا عند 450 مرة جم لمدة خمس دقائق وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من مصفوفة الطابق السفلي وبذر 20 قطرة ميكرولتر في طبق 48 بئر مسخن مسبقا.

احتضن اللوحة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية للبلمرة وأضف 250 ميكرولتر من وسط الاستزراع المكملة ب Y27632 و CHIR-99021 لكل بئر. لتحديد كفاءة التعدي ، تحقق من التألق في التحكم في التعدي تحت المجهر بعد 24 إلى 48 ساعة.