تحفيز الخلايا التائية خارج الجسم الحي في ورم البنكرياس: طريقة لزيادة إنتاج السيتوكين في الخلايا التائية

- تنتقل الخلايا التائية المنشطة إلى البيئة المكروية لورم البنكرياس ، حيث تطلق السيتوكينات مثل الإنترفيرون جاما ، أو IFN جاما ، وعامل نخر الورم - ألفا ، أو TNF alpha ، مما يساعد على التوسط في استجابة فعالة مضادة للأورام. عندما تتحرك السيتوكينات بسرعة خارج الخلية التائية ، يمكن أن تكون المستويات داخل الخلايا غير قابلة للاكتشاف. لذلك ، تتطلب الخلية التائية تحفيزا لزيادة إنتاج السيتوكين القاعدي لدراسة دورها العلاجي في الورم.

ابدأ بأخذ معلق الخلايا السرطانية من بنكرياس الفأر. الآن ، عالج الخلايا التائية الموجودة في تعليق الخلية بكوكتيل تحفيز السيتوكين واحتضان المزيج للوقت المطلوب. يسهل هذا الكوكتيل إطلاق أيونات الكالسيوم من الشبكة الإندوبلازمية إلى السيتوبلازم. مستويات الكالسيوم المرتفعة ، بدورها ، تنشط بعض عوامل النسخ النووي ، مما يؤدي إلى زيادة إنتاج السيتوكين في الخلايا التائية.

بعد ذلك ، عالج الخلايا بكوكتيل مثبط نقل البروتين واحتضان الأنبوب. يمنع هذا الكوكتيل نقل السيتوكين من الشبكة الإندوبلازمية إلى مركب جولجي ، مما يؤدي إلى تراكم السيتوكينات داخل الخلية. أخيرا ، قم بتلطيخ الخلايا باستخدام علامات مناسبة داخل الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي. في البروتوكول التالي ، سنقوم بتحفيز الخلايا التائية لزيادة تركيز السيتوكينات داخل الخلايا.

- للبدء ، استخدم الملقط لنقل الورم إلى طبق بتري. قم بتخزين 5 مل من وسط الهضم في أنبوب سعة 50 مل على الثلج لمنع بدء نشاط الإنزيم. خذ كمية صغيرة من هذا المحلول لتغطية الورم على طبق بتري. استخدم مشرطا معقما وملقطا لتقطيع الورم إلى قطع صغيرة ، يبلغ طولها أقل من 3 ملليمترات تقريبا. اكشط قطع الورم في الأنبوب واقلب الأنبوب برفق حتى تغمر جميع القطع في وسط الهضم. انقل الأنبوب إلى جهاز الاهتزاز لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية للهضم. تأكد من أن جميع قطع الورم مغمورة وليست ملتصقة بحافة الأنبوب.

مباشرة بعد خطوة الهضم ، ضع الأنبوب على الجليد لإبطاء نشاط الإنزيم. أضف EDTA لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 20 ملليمولار وقم بتدوير العينة لفترة وجيزة لخلطها من أجل إبطاء نشاط الإنزيم. افتح الأنبوب واشطف أي هضم ورم من غطاء الأنبوب بوسط RPMI جديد. ثم قم بإعداد مصفاة 70 ميكرون. ضعه على أنبوب مفتوح سعة 50 مل على الثلج. بلل الفلتر مسبقا بمتوسط. أعد تعليق الخلايا المهضومة واغسل جوانب الأنبوب باستخدام شريط سعة 25 مليلتر أو أكبر. تسمح الفتحة الأوسع للشريط بمرور الهضم السميك بسهولة.

انقل كل الملخص إلى المصفاة باستخدام شريط سعة 25 مل. اهرسي الورم أعلى ولأسفل أعلى الفلتر باستخدام مكبس حقنة سعة 1 ملليلتر. اغسل الخلايا باستمرار من خلال المصفاة باستخدام RPMI. تأكد من غسلها بقوة كافية لدفع الخلايا من خلالها. استمر في الغسيل حتى تمر جميع الخلايا عبر المصفاة. جهاز الطرد المركزي للأنبوب لمدة خمس دقائق عند 300 مرة جم و 4 درجات مئوية.

أعد تعليق حبيبات الخلية بعناية وأكمل RPMI, وقم بالمرور مباشرة عبر مرشح آخر لإزالة أي مصفوفة خارج الخلية أو كتل خلايا كبيرة لا يمكن تعليقها بشكل كاف. إذا لم تكن هناك حاجة إلى التحفيز، فقم بتلطيخ الخلايا المعزولة على الفور لتحليل قياس التدفق الخلوي أو أعد تعليقها في وسط تجميد بنسبة 10٪ DMSO في FBS وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

لإجراء التحفيز ، أولا ، عد الخلايا. خفف الخلايا في وسط كامل لتحقيق تركيز 2 في 10 إلى 6 لكل 100 ميكرولتر. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا في كل بئر من صفيحة بئر 96 ذات قاع U. أضف 100 ميكرولتر من الوسط الكامل الذي يحتوي على 2X مستحضر من PMA والأيونوميسين. ضع الطبق في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من مستحضر 10X من Brefeldin-A و Monensin والوسائط الكاملة لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 1.06 ميكرومولار و 2.0 ميكرومولار ، على التوالي. ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة لمدة أربع ساعات أخرى.