JoVE Encyclopedia of Experiments
أبحاث السرطان
0 مشاهدات • 5:10 د • April 30th, 2023
- جزر البنكرياس هي مجموعة من خلايا البنكرياس المنتجة للهرمونات والتي تلعب دورا مهما في الحفاظ على توازن الجلوكوز. يؤدي تركيز الجلوكوز المرتفع إلى إغلاق قنوات أيونات البوتاسيوم ، مما يمنع تدفق أيونات البوتاسيوم ، مما يؤدي إلى إزالة استقطاب الغشاء. نتيجة لذلك ، تفتح قنوات أيونات الكالسيوم المعتمدة على الجهد ، مما يسمح بتدفق أيونات الكالسيوم. يحفز هذا التركيز المتزايد للكالسيوم العصاري الخلوي إفراز هرمونات مثل الأنسولين. في الوقت الفعلي ، لتصوير ديناميكيات الكالسيوم العصارية الخلوية ، انقل بعض الجزر المحملة بصبغة مؤشر الكالسيوم المناسبة بين جدران الفاصل لشبكة دقيقة مجمعة مسبقا.
ضع الشبكة رأسا على عقب على غطاء داخل غرفة التصوير بالمجهر المقلوب. ضع شبكة خشنة ووزنا لشل حركة الخلايا. أضف محلول التصوير إلى الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد نظام التروية لإدخال الجلوكوز أو هرمون الاختبار ذي الأهمية. داخل الخلايا ، تشير مؤشرات الكالسيوم الفلوري المحملة مسبقا إلى أي زيادة في تركيزات الكالسيوم العصاري الخلوي. عند الارتباط بأيونات الكالسيوم ، تظهر جزيئات المؤشر زيادة كبيرة في انبعاث التألق. في البروتوكول التالي ، سنعرض التصوير في الوقت الفعلي لديناميكيات الكالسيوم في جزر البنكرياس الفئرانية استجابة لتروية الجلوكوز.
- لتثبيت الجزر الصغيرة للتصوير ، قم بتجميع غرفة تصوير لمجهر مقلوب وضع غطاء زجاجي داخل الغرفة. تأكد من أن واجهة الغرفة الزجاجية مانعة لتسرب الماء وتأكد من أن الغطاء في متناول هدف المجهر. بعد ذلك ، قم بقص مربعات 20 × 20 ملم من الشبكة الدقيقة والخشنة واستخدم قطعا من 45 إلى 50 ميكرومتر من الشريط اللاصق السميك لإنشاء جدارين فاصلين على قطعة من الشبكة الدقيقة. اغمر الشبكة الخشنة والوزن في طبق بتري 35 ملم من محلول التصوير وضع الشبكة الدقيقة تحت مجهر تشريح.
اقلب الشبكة الدقيقة مع وضع جدران الفواصل رأسا على عقب وتوجيه الفواصل لأعلى واستخدم ماصة P20 لنقل عدة جزر صغيرة بين الفواصل. باستخدام ملقط صانع الساعات، ضع الشبكة رأسا على عقب داخل حجرة التصوير في المجهر المقلوب بحيث تكون الفواصل متجهة لأسفل لتجلس مباشرة على غطاء الغرفة، مما يؤدي إلى محاصرة الجزر الصغيرة بين الفواصل والشبكة في منتصف زلة الغطاء.
- احرص على أن تكون الشبكة رطبة جيدا دون احتواء كميات زائدة من المحلول ، مما قد يثير الحركة الجانبية للعينة.
- بعد ذلك ، ضع الشبكة الخشنة والوزن فوق الشبكة الدقيقة في الغرفة وأضف محلول التصوير إلى الغرفة. بمجرد تجميد الجزر الصغيرة ، حدد وضع التصوير والهدف على المجهر المقلوب وضع الغرفة مع الجزر الصغيرة في مرحلة التحكم في درجة الحرارة في المجهر. بعد ضبط الانضهار ، ضع التدفق الداخل أقل من التدفق الخارج داخل الغرفة واضبط تدفق التدفق ليكون أكبر من تدفق التدفق.
تأكد من أن التدفق الخارج له الحد الأدنى من الاتصال بالمحلول بحيث يزيل المحلول في قطرات صغيرة متسلسلة متعددة من فترات الانتظار الطويلة لإزالة المحلول المستمر. بعد ذلك ، ابدأ بتحويل الانفجار بمحلول تصوير يحتوي على 3 مللي مولار من الجلوكوز وحدد مسار الضوء والمرشحات لتصوير الفلوروفورات الخضراء. بعد ذلك، قم بتشغيل التصوير المباشر لإعداد معلمات التصوير وضبط العرض لالتقاط الجزر الصغيرة ذات الأهمية.
لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء للصورة ، اضبط شدة ضوء الإثارة ووقت التعرض والتجميع ، مما يضمن أن الإعدادات تسمح بتصور مميز لكل خلية داخل الجزر بأقل قدر ممكن من شدة الضوء والتعرض. بعد ذلك ، قم بتصوير الجزر الصغيرة من 0.1 إلى 5 هرتز ، والتحقق من جودة البيانات المكتسبة عند التقاطها.
يفصل هذا المقال بروتوكولاً للتصوير في الوقت الحقيقي لديناميكيات الكالسيوم السيتوبلازمي في جزر البنكرياس الفأرية استجابةً لتروية الجلوكوز. تتضمن الطريقة تثبيت الجزر واستخدام مؤشرات الكالسيوم الفلورية لتصور التغيرات في تركيز الكالسيوم.
يتيح التصوير في الوقت الحقيقي لديناميكيات الكالسيوم السيتوسولية في المجموعات الفرعية لجزر البنكرياس استقصاءً دقيقاً لآليات إفراز الهرمونات المركزية في أبحاث الأمراض الأيضية. وتدعم هذه التقنية الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الوظيفية في مرحلة الاكتشاف المبكرة، لا سيما بالنسبة لمجموعات أبحاث السكري والاضطرابات الأيضية. كما تسهل مخرجاتها الكمية التكامل القوي للبيانات عبر الوظائف المختلفة وتوجه قرارات التقدم المعدلة وفقاً للمخاطر.
تتكامل تقنية التصوير هذه عند نقطة التلاقي بين مرحلة الاكتشاف المبكر وتحديد المركبات الواعدة، مما يدعم كلًا من التحقق من الأهداف القائم على الفرضيات وتطوير المقايسات لأبحاث الأمراض الأيضية.
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
آخر تحديث: 22 أغسطس 2026