عزل خلايا أسينار الأولية: طريقة لعزل خلايا أسينار من بنكرياس الفأر

- خلية البنكرياس أسينار هي خلية خارجية تحتوي على مجموعة متنوعة من الإنزيمات الهاضمة. في بعض الأحيان ، استجابة للإشارات المسرطنة ، تتحول الخلية الأسينار إلى خلية قنوية. يمكن أن تصبح هذه الخلية القنوية سرطانية لاحقا. لذلك ، من الضروري عزل الخلايا الأسينار لدراسة دورها في تطور سرطان البنكرياس.

ابدأ بعزل البنكرياس عن الفأر القتل الرحيم. أضف البنكرياس إلى قارب وزن يحتوي على محلول ملح متوازن مكمل بمضاد حيوي. افرم البنكرياس إلى قطع صغيرة باستخدام المقص وأضف أنسجة البنكرياس إلى أنبوب. بعد ذلك ، أضف محلول الكولاجيناز إلى قطع البنكرياس في الأنبوب.

يهضم الكولاجيناز الكولاجين الذي يربط الأنسجة معا بحيث ينقسم النسيج إلى قطع رفيعة. الآن ، أضف وسائط تحتوي على مصل إلى الأنبوب وضع الأنسجة على الجليد. هذا يساعد على وقف عمل الكولاجيناز.

قم بتصفية الأنسجة والوسائط مرتين ، مع تقليل حجم شبكة المرشح تدريجيا في كل مرة للحصول على تعليق ناعم للنسجة. أخيرا ، قم بالطرد المركزي للتعليق الناتج لجمع خلايا الأسينار في الحبيبات. قم بإزالة المادة الطافية وتخزين الخلايا الطافية لمزيد من التحليل. في البروتوكول التالي ، سنقوم بعزل خلايا أسينار عن بنكرياس الفأر القتل الرحيم.

- لتشريح البنكرياس من فأر قتل رحيم ، قم أولا بتثبيت أقدام الفأر على غطاء البوليسترين ، وتوجيهه بحيث يكون الذيل مواجها للباحث ، ورش البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. استخدم ملقطا معقما لرفع الفراء والجلد عند خط الوسط ، وباستخدام مقص معقم ، قم بعمل شق عبر الفراء والجلد من فتحة مجرى البول إلى منطقة القفص الصدري للحجاب الحاجز. قم بعمل شقوق إضافية على اليسار واليمين لقطع الفراء والجلد ، مما يخلق رؤية واضحة لتجويف البطن.

ثم قم بتقطيع البطانة البريتونية إلى أسفل المنتصف وإلى اليمين واليسار ، واسحبها بعيدا عن الأعضاء. استخدم الملقط لرفع الأمعاء ونقلها إلى الجانب الأيسر من الفأر ، مما يوفر مساحة لرؤية البنكرياس الوردي الفاتح المتصل بالطحال البيضاوي الأحمر الداكن. سيكون لأنسجة البنكرياس ملمس إسفنجي ناعم. قطع البنكرياس ، الذي يمتد على طول المعدة ، متشابكا مع الأمعاء.

افصل الطحال عن البنكرياس وضع البنكرياس في أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من HBSS مع 1X البنسلين والستربتومايسين وانقله إلى غطاء التدفق الرقائقي. صب محتويات الأنبوب في قارب وزن فارغ واستخدم ملقطا لغسل البنكرياس عن طريق تحريكه. ثم استخدم الملقط لنقل البنكرياس إلى قارب وزن ثان يحتوي على HBSS مع البنسلين والستربتومايسين واغسله مرة أخرى عن طريق الدوران.

انقل البنكرياس إلى قارب الوزن الثالث الذي يحتوي على HBSS مع البنسلين والستربتومايسين وابدأ في تقطيع البنكرياس إلى قطع 5 ملليمترات أو أصغر. لصب محتويات قارب الوزن في أنبوب جديد سعة 50 مليلتر ، استخدم الملقط أولا لتحريك قطع البنكرياس إلى السائل أثناء قلب القارب. بمجرد أن تتوقف القطع عن القارب ، اسكب محتوياتها في الأنبوب. التقط أي قطع متبقية بالملقط واغسل الملقط في الأنبوب.

بعد الطرد المركزي للأنبوب عند 931 ضعف الجاذبية عند 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين ، استخدم ماصة سعة 5 ملليلتر لإزالة HBSS وأي دهون عائمة. أضف 5 مل من الكولاجيناز المخفف في HBSS. أغلق الأنبوب وتأكد من غطاء محكم الغلق عن طريق لف الأنبوب بغشاء بارافين بلاستيكي. ضعه في حاضنة ، مع رجه عند 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، مما ينتج عنه محلول عكر وعدد قليل من قطع الأنسجة المتبقية.

لإيقاف التفكك ، ضع الأنبوب على الثلج وأضف 5 مل من HBSS البارد مع 5٪ FBS. بعد الطرد المركزي عند 931 ضعف الجاذبية عند 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين ، قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 5 ملليلتر. أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من HBSS مع 5٪ FBS وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 931 ضعف الجاذبية لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.

قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 5 ملليلتر وكرر هذه الخطوة مع 10 مل أخرى من HBSS مع 5٪ FBS. ثم أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من HBSS مع 5٪ FBS. استخدم ماصة P1000 لتصفية معلق الخلية 1 ملليلتر في المرة الواحدة من خلال شبكة 500 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 ملليلتر.

لغسل أي خلايا بنكرياس متبقية من خلال الشبكة ، أضف 5 ملليلتر إضافي من HBSS مع 5٪ FBS. ثم استخدم ماصة P1000 لتمرير هذا الترشيح 1 ملليلتر في المرة الواحدة عبر شبكة 105 ميكرومتر إلى أنبوب سعة 50 مل. قم بتثبيت معلق الخلية هذا برفق في أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على HBSS مع 30٪ FBS، والذي سيشكل طبقة من تعليق الخلية في الأعلى.

جهاز الطرد المركزي هذا المعلق الخلوي عند 233 ضعف الجاذبية عند 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات التي تحتوي على خلايا الأسينار في وسط 1X Waymouth الكامل.