عزل جزر البنكرياس من خلال نضح الكولاجيناز: طريقة إنزيمية لعزل خلايا جزر البنكرياس

- تنتج الخلايا الجزرية في البنكرياس هرمونات أساسية تشارك في وظائف الغدد الصماء. لعزل الجزر ، أولا ، قم بتأمين فأر قتل رحيم وفضح تجويف البطن جراحيا. قم بتنظيف الكبد والأمعاء جانبا لتحديد موقع القناة الصفراوية المشتركة وتثبيتها. حدد أمبولة فاتر ، القناة التي تشكلت من اتحاد البنكرياس والقنوات الصفراوية الشائعة.

بعد ذلك ، قم بحقن محلول إنزيم الكولاجيناز في القناة الصفراوية المشتركة. يعمل التدفق العكسي من القناة على تضخيم البنكرياس بنجاح ، مما يسهل تفكك أنسجة البنكرياس الناجم عن الكولاجيناز. استئصال البنكرياس في أنبوب يحتوي على المزيد من محلول الكولاجيناز. قم بتقطيع الأنسجة ميكانيكيا واحتضانها للمساعدة في هضم الأنسجة بواسطة الكولاجيناز.

بمجرد الحصول على تعليق متجانس ، أوقف الهضم الأنزيمي عن طريق إضافة محلول يحتوي على بروتينات تمنع نشاط الكولاجيناز. جهاز طرد مركزي لجمع حبيبات الأنسجة. أعد تعليق الحبيبات في وسط تدرج الكثافة المناسب ، ووضع طبقة عازلة مناسبة فوقها ، وجهاز طرد مركزي لتوليد طبقات متدرجة.

اجمع الجزر الصغيرة من الطبقة المتكونة بين وسط تدرج الكثافة والمخزن المؤقت. أخيرا ، اختر الجزر الصغيرة الصحية للزراعة. في البروتوكول التالي ، سنوضح عزل جزر البنكرياس الفئرانية عن طريق إعطاء الكولاجيناز متبوعا بالطرد المركزي المتدرج للكثافة.

- ابدأ بلصق أطراف الفأر في وضع ضعيف ورش الجسم بنسبة 70٪ من الإيثانول. باستخدام ملقط زجاجي للغطاء ومقص جراحي منحني ، قم بعمل شق أفقي في جلد البطن بطول 3 سم تقريبا ، واسحب الجلد لكشف جدار البطن. قم بعمل شق عمودي من 3 إلى 4 سنتيمترات على الصفاق البطني لكشف البنكرياس بالكامل ، وضع الفأر تحت مجهر تشريح.

ادفع فص الكبد بشكل متفوق لكشف القناة الصفراوية ، التي تظهر على شكل أنبوب وردي شاحب ، وحرك الأمعاء برفق من المنطقة القطنية والحرقفية اليمنى إلى يمين تجويف البطن لكشف القناة الصفراوية والشريان الكبدي. استخدم Schwartz Micro Serrefines لتثبيت القناة الصفراوية المشتركة بعناية بالقرب من الكبد قدر الإمكان وتحديد أمبولة Vater ، التي تقع في حليمة الاثني عشر وتتكون من اتحاد قناة البنكرياس والقناة الصفراوية المشتركة.

باستخدام ملقط Micro Adson لسحب القناة الصفراوية المشتركة مشدودة ، أدخل إبرة قياس 30 نصف بوصة متصلة بحقنة 3 ملليلتر تحتوي على 3 ملليلتر من محلول الكولاجيناز P المحضر حديثا في أمبولة Vater ، مما يدفع الإبرة إلى القناة الموازية للوعاء لحوالي ربع طول الوعاء. بمجرد وضع الإبرة في مكانها ، قم بتثبيت الإبرة باستخدام ملقط Micro Adson وحقن 3 ملليلتر من محلول الكولاجيناز P ببطء وثبات في القناة. يعتبر الحقن ناجحا إذا تم نفخ مناطق الرأس والرقبة والجسم والذيل في البنكرياس بالكامل.

- يعد الدخول السليم إلى الأمبولة وقنية القناة الصفراوية المشتركة أمرا بالغ الأهمية لحصاد الهضم الناجح. ثقب جدران الأقنية يقلل من فعالية العزلة.

- باستخدام ملقط منحني ودقيق Adson ، اسحب البنكرياس المنتفخ بعناية بدءا من الطحال واستمر باتجاه المعدة وعلى طول الاثني عشر. ثم ضع البنكرياس في أنبوب هضم سعة 50 مل يحتوي على 3 ملليلتر من محلول الكولاجيناز P المثلج. لحصاد الجزر ، استخدم أولا مقصا جراحيا دقيقا لتقطيع البنكرياس لمدة 3 إلى 5 ثوان قبل وضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية بمعدل 100 إلى 120 دورة في الدقيقة لمدة 12 إلى 13 دقيقة.

في نهاية الحضانة ، قم بهز الأنبوب برفق لمدة 30 ثانية تقريبا لتعطيل الأنسجة حتى يصبح المحلول متجانسا ، كما تؤكده جزيئات أنسجة البنكرياس الدقيقة الشبيهة بالرمل. بمجرد هضم الأنسجة ، ضع الأنبوب على الثلج وأضف 40 مل من محلول التوقف المثلج البارد لإنهاء التفاعل الأنزيمي. بعد تعطيل الحبيبات برفق ، قم بتدوير الأنسجة الهضمية في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح متبوعا بجهازي طرد مركزي مع 20 مل من محلول التوقف الطازج لكل غسلة.

بعد الغسيل الأخير, أعد تعليق الحبيبات في 40 مل من HBSS المثلج لثلاث غسلات إضافية, إعادة تعليق الحبيبات في 5 مل من محلول التدرج كثافة درجة حرارة الغرفة بعد الغسيل الأخير. قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة بسرعة منخفضة حتى يتجانس المحلول قبل إضافة 5 ملليلتر أخرى من تدرج كثافة درجة حرارة الغرفة إلى الأنبوب. استخدم الآن ماصة مقاس 10 ملم لإضافة 10 ملليمترات من HBSS بدرجة حرارة الغرفة برفق وببطء إلى الأنبوب بطريقة قطرية للسماح بتكوين تدرج ، واستخدم جهاز طرد مركزي دلو متأرجح لعزل مجموعات الخلايا عن طريق فصل تدرج الكثافة.

في نهاية الطرد المركزي ، استخدم ماصة سعة 10 ملليلتر ، مبللة مسبقا باستخدام HBSS بارد لتجميع 5 إلى 10 ملليلتر من طبقة الجزيرة بين تدرج الكثافة و HBSS. انقل الجزر إلى أنبوب جديد سعة 50 مليلتر يحتوي على 20 مل من HBSS الطازج المثلج ، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح. قم بشفط كل ما عدا آخر 3 ملليلتر من المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات ، واغسل الجزر ثلاث مرات أخرى على الأقل باستخدام 20 مل من HBSS الطازج لكل غسلة.

بعد الغسيل الأخير ، استبدل المادة الطافية ب 4 ملليلتر من 37 درجة مئوية RPMI 1640 متوسطة وقم بتدوير الأنبوب برفق لإخراج الحبيبات. اسكب الجزر على الفور في طبق بتري مقاس 100 ملم ، واغسل الأنبوب ب 5 ملليلتر من وسط RPMI 1640 الطازج لجمع أي جزر متبقية ، وتجميع الغسيل مع الجزر الأخرى.

ثم استخدم مجهر تشريح وطرف ماصة سعة 20 ميكرولترا لاختيار جزر كروية أو مستطيلة ذات لون بني ذهبي مع سطح أملس من طبق بتري لنقلها إلى طبق بتري جديد يحتوي على 10 ملليلتر من وسط RPMI 1640 الكامل. عندما يتم جمع جميع الجزر ، ضع الجزر في الحاضنة المعقمة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في الهواء المرطب طوال الليل.