تلطيخ الفلورسنت المناعي للكرويات: تقنية لتحليل الكرويات للتعبير عن التعبير عن المستضد داخل الخلية وخارجها

- الكرويات هي نماذج ثلاثية الأبعاد لزراعة الخلايا في المختبر. بالنسبة لتلوين الفلورسنت المناعي ، أولا ، قم بإنشاء ثقافة كروية من نوع الخلية المطلوب في صفيحة متعددة الآبار. باستخدام ماصة دقيقة ذات طرف فتحة عريضة ، اجمع الكرويات ، مع الحرص على تجنب التمزق بسبب قوى القص.

بعد ذلك ، قم بإصلاح الكرات ونفاذها لجعل الخلايا الفردية قابلة للنفاذ. الآن ، احتضن بمحلول يحتوي على بروتينات لمنع مواقع تفاعل البروتين غير المحددة على سطح الخلية. عالج الكرات بكوكتيل الأجسام المضادة الأولية المرغوبة. احتضان الأجسام المضادة للارتباط بالجزيئات المستهدفة على سطح الخلية.

بعد ذلك ، قم بتسمية الأجسام الكروية بمحلول أجسام مضادة ثانوية مصنفة فلورسنت خاص بالأجسام المضادة الأولية. أخيرا ، عالج الكرات بصبغة مناسبة ملزمة للحمض النووي الفلوري لتلطيخ نوى الخلايا. باستخدام مجهر مضان بالمسح بالليزر ، قم بتصوير مقاطع عرضية بصرية متعددة للكروي في مستويات بصرية مختلفة.

تعكس الصور الملتقطة النوى والمستضدات ذات العلامات الفلورية ذات الأهمية. ادمج المكدسات باستخدام البرامج ذات الصلة للحصول على الصورة المركبة النهائية للكروي ثلاثي الأبعاد. في البروتوكول التالي ، سنقوم بإجراء تلطيخ فلوري مناعي للكبوتات الكروية للأرومات الليفية البنكرياسية والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان المزروعة في وجود منبه ، TGF beta 1.

- أولا ، قم بقطع نهاية طرف الماصة لتكبير الفتحة. بعد اكتمال الحضانة ، استخدم طرف الماصة المقطوعة هذا لتجميع الكرويات في أنبوب تفاعل واحد سعة 1.5 مليلتر ، لكل حالة تجريبية أو لكل بروتين ليتم تحليله. الطرد المركزي الكروية عند 1,000 مرة غرام لمدة 30 إلى 60 ثانية. قم بإزالة ميثيل السليلوز المحتوي على مادة طافية بعناية عن طريق سحب العينة ، مع التأكد من عدم إزعاج الكرويات المحببة.

- يجب توخي الحذر بشكل خاص عند نقل الكرويات إلى أنابيب التفاعل. تأكد من عدم وجود قوى إجهاد القص عن طريق قطع الحافة. من المهم أيضا أن تجمع كل الكرات الكروية. أثناء خطوة الغسيل ، تأكد من عدم فقدان الكرويات عن طريق الشفط.

- لغسل الكرات عند 50 ميكرولتر من 1X PBS ، قم بجهاز الطرد المركزي عند 1,000 مرة جم لمدة 30 إلى 60 ثانية ، ثم قم بإزالة PBS بعناية عن طريق سحب العينات. اعتمادا على البروتين المراد تلطيخه ، قم بإصلاح الكرات إما ب 50 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

اغسل الأكروية باستخدام PBS كما هو موضح سابقا. تخلل الخلايا بنسبة 0.1٪ Triton X في PBS لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الكرويات في PBS ثلاث مرات ، كما هو موضح سابقا. أضف PBS الذي يحتوي على 5٪ FBS و 2٪ BSA إلى الفيريات واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة لمنع مواقع تفاعل البروتين غير المحددة.

الآن ، احتضان الكرويات ب 30 ميكرولترا من الأجسام المضادة الأولية في PBS مع 2.5٪ FBS و 1٪ BSA عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، اغسل الكرات في PBS ثلاث مرات كما هو موضح سابقا.

بعد ذلك ، قم باحتضان الكرات ب 30 ميكرولترا من الأجسام المضادة الثانوية في PBS مع 2.5٪ FBS و 1٪ BSA في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة. اغسل الكرات في PBS ثلاث مرات كما هو موضح سابقا.

بعد ذلك ، احتضان الخلايا ب 30 ميكرولتر من محلول تلطيخ DAPI لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الكرات في PBS مرة واحدة كما هو موضح سابقا. باستخدام ماصة باستور زجاجية ، ضع الكرات الكروية على شريحة زجاجية في قطرة من PBS. استخدم مجهر المسح الضوئي بالليزر لتصوير الكرات الكروية عن طريق المجهر الفلوري بتكبير 10 مرات. خذ مقطعا عرضيا بصريا مختلفا للكرة الكروية في مستويات بصرية مختلفة من مكدس Z.