JoVE Encyclopedia of Experiments
أبحاث السرطان
0 مشاهدات • 4:24 د • April 30th, 2023
- عقدة الجذر الظهري أو DRG هي خلايا عصبية حسية تنقل الرسائل من المحيط إلى الجهاز العصبي المركزي. في المقابل ، تشارك الخلايا العصبية الضفيرة العضلية المعوية في الحركات التمعجية للأمعاء.
في حالات السرطان مثل سرطان البنكرياس ، تتغير هذه الخلايا العصبية شكليا ووظيفيا. لدراسة تغيرات مورفولوجيا الخلايا العصبية ، قم بزرع الخلايا العصبية على أغطية مغلفة مسبقا ببروتين اللامينين ، وتوضع في صفيحة متعددة الآبار ، وتصدر الخلايا بالوسط القاعدي العصبي.
يعزز بروتين اللامينين نمو العصب. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها. بعد ذلك ، أضف وسائط استخراج أنسجة سرطان البنكرياس إلى الآبار الثلاثة الأولى ووسائط استخراج أنسجة البنكرياس الصحية إلى الآبار الثلاثة اللاحقة. احتضان اللوحة. الآن ، قم بإجراء تلطيخ كيميائي مناعي باستخدام علامات الأجسام المضادة الخاصة بالخلايا العصبية ، والتي ترتبط بالخلايا العصبية. ضع الغطاء على الشريحة الزجاجية وضع الشريحة تحت مجهر مقلوب. قياس كثافة النوريت باستخدام البرنامج.
عادة ما تظهر الخلايا العصبية DRG المزروعة في مستخلص أنسجة سرطان البنكرياس كثافة عصبية أكبر من مستخلص أنسجة البنكرياس الصحية. في المقابل ، تشكل الخلايا العصبية الضفيرة العضلية الأعمدة عصبيات أطول من مقتطفات أنسجة البنكرياس الصحية. في البروتوكول التالي ، سنقوم بإجراء فحص المرونة العصبية في المختبر على الخلايا العصبية DRG والضفيرة العضلية المعوية للفأر حديث الولادة.
- لتحضير الخلايا للثقافة ، استخدم مقياس كثافة الدم لتقدير العدد الإجمالي للخلايا العصبية والخلايا الدبقية. بعد ذلك ، قم بزرع الخلايا على أغطية مغلفة مسبقا مقاس 13 ملم في صفيحة 24 بئرا. يعتمد الطلاء المستخدم على الأهداف التجريبية. بعد ذلك ، ضع الآبار فوق الوسط القاعدي العصبي واسمح للخلايا بالالتصاق بالآبار بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بإذابة مستخلص الأنسجة المكمل بالوسائط ، أو الوسائط الطافية المكملة لخط الخلية.
بعد ذلك ، قم بشفط وسط البذر من DRGs وقم بإجراء غسيل اختياري لطيف للغاية باستخدام PBS. بعد ذلك ، قم ببطء بسحب الوسائط المكملة لمستخلص الأنسجة أو الوسائط الطافية المكملة بخط الخلية على الخلايا لإنتاج 100 ميكروغرام لكل مليلتر. الآن ، دع الخلايا تنمو لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في مستخلص الأنسجة أو الوسائط الطافية التي يتم توفيرها لخط الخلية. بعد 48 ساعة ، قم بشفط الوسائط وقم بتثبيتها في 4٪ بارافورمالدهيد للتلوين المناعي.
بالنسبة للتلطيخ المناعي المزدوج ، استخدم علامات خاصة بالخلايا العصبية والخاصة بالدبقية. لقياس التشكل ، استخدم مجهر ضوئي مقلوب مزود بكاميرا CCD مع برنامج آلي لقياس كثافة العصب. باستخدام تكبير 200X ، قم بقياس كثافة العصبية للثقافات العصبية عن طريق تراكب شبكة 50 × 50 ميكرون وحساب كثافة الألياف لكل مربع ، مقاسة في الألياف المتقاطعة. كرر هذا التحليل لأربع مناطق مختلفة من النمو الأكثر كثافة على أربعة إلى خمسة صور مجهرية تمثيلية في كل غطاء.
قم بقياس نمو الخلايا العصبية ، ومتوسط عدد الفروع لكل خلية عصبية ، ومتوسط طول الفرع ، وحجم حوط النوبة من 30 خلية عصبية انفرادية مختارة عشوائيا من كل غطاء عن طريق وضع علامة على العصبية والبريكاريا.