مراقبة البيئة المكروية للورم القائمة على PTM: طريقة لتتبع التغييرات في صلابة ECM باستخدام كرويات الورم

- في غزو الورم ، تخضع الخلايا السرطانية المحيطية لانتقال ظهاري إلى لحمة متوسطة أو EMT ، مما يؤدي إلى تدهور موضعي للمصفوفة خارج الخلية أو ECM. يمكننا دراسة تفاعل الخلايا السرطانية مع ECM في المختبر.

لدراسة هذه التفاعلات ، قم بنقل كروي مشكل مسبقا مشتق من خلايا ورم البنكرياس إلى صفيحة تحتوي على سقالة كولاجين جنبا إلى جنب مع مجسات تتبع الفلورسنت المدمجة ووسائط الاستزراع. يطلق الورم الكروي البروتياز ، الذي يتحلل الكولاجين ويقلل من صلابة ECM ، مما يؤدي إلى حرية حركة مجسات التتبع في ECM.

احتضان اللوحة للمدة الزمنية المطلوبة. راقب العينة تحت المجهر الضوئي لإلقاء نظرة على شبكة نقاط العينة في سقالة الكولاجين وتسجيل بيانات الفيديو منها. تظهر منطقة المصفوفة بالقرب من الكرة أقصى قدر من تدهور الكولاجين. لذلك ، فقد زادت من حركة المسبار. في المقابل ، تظهر المنطقة البعيدة عن الكرة تدهورا أقل للكولاجين ، مما يؤدي إلى تقييد حركة جزيئات المسبار.

تقنية فحص الخصائص الريولوجية ل ECM عن طريق قياس مسارات جسيمات التتبع باسم علم الريولوجيا الدقيقة لتتبع الجسيمات أو PTM. في البروتوكول التالي ، سنقوم بإجراء اختبار تكوين الكرة لتحديد الخلايا الجذعية لسرطان البنكرياس وتقييم تأثير الميتفورمين.

للبدء ، قم بإعداد محطة عمل داخل غطاء تدفق رقائقي مع قارورتين سعة 2 ملليلتر. ستحتوي القارورة 1 على كروي الورم ، وستكون القارورة 2 عبارة عن تحكم خال من الخلايا. قم بإعداد خليط مخفف من مجسات تتبع الفلورسنت المعدلة بالكربوكسيل بقطر 1 ميكرون عن طريق إضافة جزأين من مجسات المخزون إلى 25 جزءا من الماء المعقم.

أخرج زجاجة تحتوي على 3.1 ملليغرام لكل مليلتر من الكولاجين البقري من الثلاجة وضعها على الثلج. Aliquot 125 ميكرولتر من الكولاجين متبوعا ب 50 ميكرولترا من محلول مسبار التتبع المخفف في قارورة 1. دوامة لفترة وجيزة لتوزيع المجسات.

ثم أضف 235 ميكرولترا من وسائط زراعة الخلايا المناسبة التي تحتوي على الفينول الأحمر لحجم إجمالي يبلغ 410 ميكرولتر ودوامة لفترة وجيزة قبل إزالة 205 ميكرولتر ووضعها في قارورة 2. بعد ذلك ، أضف ما يقرب من 2 ميكرولتر من 1 مولي هيدروكسيد الصوديوم إلى القارورة 1 لإعادة المحلول إلى درجة الحموضة المحايدة. دوامة لفترة وجيزة للخلط. ثم عد إلى رف الثلج على الفور حتى لا يبدأ الخليط في المعالجة.

قم بإزالة 40 ميكرولترا من الوسائط برفق من البئر التي تحتوي على الورم الكروي. احتفظ بهذا 40 ميكرولتر أثناء إجراء الخطوة التالية. تحقق من البئر لمعرفة ما إذا كان قد تمت إزالة الكروية في الخطوة السابقة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، ضع 40 ميكرولترا مرة أخرى في البئر وكرر الخطوة السابقة.

إذا كان الأمر كذلك ، أضف 40 ميكرولترا تحتوي على الكروية إلى القارورة 1. قلب القارورة 1 برفق قبل نقل الخليط إلى أجزاء سعة 60 ميكرولتر إلى ثلاثة آبار منفصلة من صفيحة سعة 96 بئرا. افحص كل بئر بالمجهر بعد إضافة الخليط لتحديد البئر الذي يحتوي على الكروية.

ثم أضف ما يقرب من 2 ميكرولتر من 1 ميكروكسيد صوديوم مولار و 40 ميكرولترا من وسط زراعة الخلايا إلى القارورة 2 ، والدوامة قبل اقتباس 60 ميكرولترا من هذا الخليط إلى بئر فارغ في الصفيحة المكونة من 96 بئرا وتصنيفها على أنها تحكم خال من الخلايا. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية للعلاج لمدة ساعة واحدة على الأقل.

لإنشاء شبكة من نقاط العينة ، أولا ، انقل لوحة العينة من الحاضنة إلى مرحلة المجهر. اترك 10 دقائق حتى تتوازن العينة مع درجة حرارة الغرفة في حالة عدم توفر مرحلة ساخنة. راقب العينة باستخدام عدسات موضوعية منخفضة الطاقة للتأكد من أنها سليمة وجاهزة للتصوير. حدد موضع الورم داخل البئر ، وقم بتوثيق ذلك باستخدام صورة ضوئية مرسلة للتسجيل المشترك المكاني اللاحق.

عادة ما تنتج 20 نقطة عينة في كل بئر موزعة في حلقات متحدة المركز حول الكروي نتائج مفصلة بشكل كاف. انقل المسرح إلى كل موضع مرغوب فيه واستخدم برنامج الربط المجهري لتسجيل إحداثيات x و y.

قم بتبديل المجهر إلى عدسة موضوعية عالية الطاقة ، وحدد مكعب المرشح المناسب للطول الموجي للإثارة لمسبارات التتبع. باستخدام قائمة النقاط التي تم إنشاؤها، انتقل إلى النقطة الأولى في الشبكة. اضبط التركيز للعثور على الجزء السفلي من البئر قبل التحرك لأعلى للعثور على مجال رؤية يحتوي على العديد من مجسات التتبع في التركيز البؤري.

راقب الرسم البياني للشدة واضبط شدة التعريض الضوئي والوقت لإعطاء أكبر نطاق ديناميكي ممكن مع التأكد من عدم تشبع الصورة. احصل على تسلسل فيديو بمعدل إطارات يتراوح من 20 إلى 30 مللي ثانية لكل إطار وحفظه باستخدام اصطلاح تسمية مناسب. أثناء التسجيل ، لا تلمس المجهر أو الطاولة.

كرر التسجيل لكل نقطة عينة في الشبكة. ثم تابع تكرار العملية لإنشاء شبكة لكل بئر في التجربة وكرر العملية بأكملها لكل نقطة زمنية على مدار مدة المراقبة الطولية.