تقييم بؤر تلف الحمض النووي: لتحديد بؤر تلف الحمض النووي الناجم عن الإشعاع في خط الخلايا السرطانية باستخدام تلطيخ التألق المناعي

- يؤدي الإشعاع المؤين إلى ظهور أنواع مختلفة من تلف الحمض النووي ، مثل الفواصل أحادية الشريطة أو SSBs والفواصل مزدوجة الشريطة أو DSBs. تحدث فواصل الخيط الفردي أو SSBs عندما يتلف الإشعاع القواعد ويشقق العمود الفقري للحمض النووي ، بينما تتطور فواصل الخيط المزدوج ، DSBs ، عندما يحدث اثنان من SSBs على خيوط DNA متقابلة. الخطوة الأولى لتكوين DSB هي فسفرة هيستون H2AX ، والذي يمكن تصوره عن طريق تلطيخ التألق المناعي.

لإجراء تلطيخ التألق المناعي ، أضف الأجسام المضادة الأولية إلى عينة مثبتة على زلة غطاء موضوعة في طبق بتري. ترتبط الأجسام المضادة ببروتين هيستون الفسفوري جاما-H2AX. احتضان العينة واغسلها باستخدام PBS لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة. بعد ذلك ، أضف الأجسام المضادة الثانوية التي تحمل الفلوروفورات ، والتي تتعرف على الأجسام المضادة الأولية وترتبط بها. أضف الكمية المطلوبة من صبغة الفلورسنت DAPI لمواجهة تلطيخ النوى.

قم بتركيب زلة الغطاء برفق على شريحة زجاجية بوسيط تثبيت وراقب الخلايا تحت مجهر الفلورسنت. تظهر بؤر جاما-H2AX كنقاط فلورية مميزة في الخلايا السرطانية المشععة. في البروتوكول التالي ، سنقوم بإجراء تلطيخ المناعي لخطوط خلايا سرطان القولون البشري المشعع لتحديد بؤر إصلاح الحمض النووي الناجمة عن الإشعاع.

- بعد التشعيع ، قم بإزالة الوسط من الخلايا المرفقة واغسلها مرة واحدة باستخدام