إنشاء الابتدائية الثقافات الليفية الكبار من القوارض

يبدأ عزل الخلايا الليفية القابلة للحياة من جلد وأنسجة الرئة بتشريح شظايا الجلد والرئة من جثة. باستخدام تقنية معقمة ، يتم تقطيع الأنسجة إلى أجزاء صغيرة وهضمها بالكولاجيناز. ثم يتم تحضين شظايا الأنسجة المهضومة بوسائط مزرعة غنية حتى تخرج الخلايا الليفية من الأنسجة.

أخيرا ، تتم إزالة قطع الأنسجة واستبدال الوسائط الغنية بوسائط نمو الخلايا الليفية. بعد تقسيم الخلايا ، يتم تجميد حصص الخلايا لاستخدامها في المستقبل. في النهاية ، ينتج عن جزء من الجلد أو أنسجة الرئة بحجم سنتيمتر مربع واحد 10 إلى المقطع السابع للأرومات الليفية.

والميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى التي لا تنطوي على الهضم الأنزيمي للأنسجة هي أنها تنتج أعدادا كبيرة من الخلايا من مجموعة متنوعة من العينات الحيوانية. ستساعد هذه الطريقة الباحثين في مجال علم الأحياء المقارن على عزل دماء النار بكفاءة عن مجموعة متنوعة من أنواع الثدييات. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات هضم الأنسجة والفرم لأنها بديهية وتختلف اعتمادا على الأنسجة والعينة الحيوانية المستخدمة قبل البدء في هذا الإجراء ، مقص وملقط معقمين بالأوتوكلاف 70٪ من الإيثانول ، دورق 30 مليلتر يحمل حركة مغناطيسية صغيرة بالداخل ويذوب كمية جديدة من محلول liase Zyme الثلاثة.

قم أيضا بتسخين وسائط زراعة الخلايا. عند العمل مع البرية ، تذكر أنها قد تحتوي على مسببات الأمراض مثل فيروس داء. اعمل بعناية وكن دائما على دراية بالأدوات الحادة المفتوحة.

لبدء هذا الإجراء ، قم بالقتل الرحيم للحيوان وضع الذبيحة عند أربع درجات مئوية. من الأفضل استخدام الذبيحة على الفور أو إزالة عينات الأنسجة في غضون 24 ساعة وبعد ذلك ينخفض إنتاجية الخلية. لتشريح العمل في جناح جراحي أو في غطاء كيميائي ، ولكن ليس في الأنسجة.

يجمع غطاء المزرعة عينات من الجلد من منطقة الإبط لأن جلد الإبط أرق ويحتوي على دهون أقل وأقل كثافة. أولا ، قم بتنظيف موقع الشق بنسبة 70٪ من الإيثانول. تأكد من أن الفراء غارق بالإيثانول.

ثم باستخدام مشرط حاد ، احلق الفراء حول موقع الشق ، احلق مساحة أكبر من موقع الشق المطلوب. حاول تقليل الجروح في الجلد. بعد إزالة الفراء ، رش المنطقة بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركها تجف.

لجمع عينة من الجلد ، قم باستئصال جزء من حوالي سنتيمتر واحد مربع. للقيام بذلك ، اضغط على الجلد بملقط الأنسجة وقصه بالمقص. حاول ألا تقطع الطبقة الدهنية بالجلد لأن الدهون تتداخل مع هضم الكولاجيناز اللاحق.

لتجنب الجفاف ، ضع شظايا الأنسجة في أنابيب سعة 50 مليلتر تحتوي على PBS معقم. بعد ذلك ، اجمع عينات الرئة. أولا ، اغسل منطقة الصدر بنسبة 70٪ من الإيثانول.

ثم باستخدام المقص. قم بعمل شق على شكل حرف T على جلد الصدر وقم بتفكيك اللوحات الجلدية. اغسل منطقة العضلات المفتوحة بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركها تجف.

باستخدام ملقط ومقص معقم ، افتح القفص الصدري لكشف الرئتين. لتجنب تلويث الأعضاء الداخلية ، استخدم تقنيات معقمة. على سبيل المثال ، لا تلمس الأعضاء الداخلية بالأدوات التي لامست فراء.

باستخدام ملقط ومقص معقم، قم بقطع شظايا الرئة بحجم سنتيمتر واحد مربعا تقريبا. ضع شظايا الأنسجة في أنابيب سعة 50 مليلتر مع PBS معقم أخيرا للتخلص بشكل صحيح من جثة. استخدم الإيثانول لغسل الجزء الخارجي من الأنابيب سعة 50 مليلتر التي تحتوي على شظايا الجلد وأنسجة الرئة.

ثم انقل الأنابيب إلى غطاء مزرعة الأنسجة. بعد الحصول على عينات الأنسجة ، انتقل إلى استخراج الخلايا الليفية. أولا باستخدام مشرط معقم ، انقل شظايا الأنسجة من الأنابيب إلى طبق زراعة أنسجة بطول 10 سم.

لا تنقل الكثير من PBS مع العينة باستخدام مشرطين. قطع الأنسجة إلى حوالي ملليمتر واحد. استخدم الشفرتين مع حركة المقص بدءا من المركز وتفكيكها.

تأكد من الحفاظ على كرة المناديل. لا تقطع قطعة قطعة. عندما يكون القطع كافيا ، يشبه الجلد المعجون.

لا ينفصل إلى قطع ولكنه يمتد بشكل رقيق. من السهل قطع أنسجة الرئة وتنفصل إلى قطع صغيرة. عند اكتمال القطع ، استخدم مشرطا لنقل الأنسجة المقطوعة إلى دورق معقم سعة 30 مليلتر مع وجود قضيب تقليب معقم بالداخل.

اغسل اللوحة المستخدمة لقطع المناديل ب 10 مل من وسائط D-M-E-M-F 12 ب 0.14. بمجرد وحدات لكل مليلتر من liase Zyme ثلاثة وواحد × مضاد للفطر مضاد للمضادات الحيوية ، أضف محلول الغسيل إلى دورق 30 ملليلترا. غطي الدورق بورق معقم واحتضانه على حرارة 37 درجة مئوية مع التحريك ببطء لمدة 30 إلى 90 دقيقة.

طول الحضانة على الأنواع ونوع الأنسجة. احرص على عدم الإفراط في هضم الأنسجة. يتم الحصول على أفضل الغلة عندما تظل شظايا الأنسجة موجودة في نهاية عملية الهضم.

يستغرق الجلد وقتا أطول للهضم من الرئة ، ويستغرق هضم جلد الكبيرة وقتا أطول. افحص عملية الهضم كل 30 دقيقة ثم كل 10 دقائق. عندما يكتمل هضم الجلد ، تصبح الوسائط غائمة.

تنفصل شظايا الجلد عن بعضها البعض وتصبح حواف القطع غامضة. يتوقف هضم الرئة عندما يتغير لون شظايا الرئة من الأحمر إلى الأبيض وتبدأ في تكوين ألياف لزجة ، ماصة المحلول الذي يحتوي على شظايا الأنسجة لأعلى ولأسفل لتفتيت الكتل. إذا تحركت الشظايا بسهولة عبر الماصة سعة 10 ملليلتر ، فهذا مؤشر على إجراء القطع والهضم.

حسنا ، انقل المحلول إلى أنبوب معقم سعة 50 مل. اشطف الدورق ثلاث مرات ب 10 مل من وسائط D-M-E-M-F الدافئة مع 15٪ FBS ومضاد حيوي واحد مضاد للفطريات وأضفه إلى أنبوب 50 مليلتر مع شظايا الأنسجة. أغلق الأنبوب سعة 50 مليلتر واخلطه عن طريق الانعكاس عدة مرات.

توقف FBS في وسائل الإعلام عملية الهضم المؤقت. بعد ذلك ، اغسل الخلايا التي تدور عند 524 Gs في جهاز طرد مركزي لثقافة أنسجة دلو متأرجح في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات. في 10 ملليلتر من وسائط D-M-E-M-F الدافئة 12 مع 15٪ FPS مضاد حيوي واحد X ماصة مضادة للفطريات التعليق بأقصى قوة.

لكسر قطع المناديل ، أضف 30 مل أخرى من الوسائط وكرر الغسيل. اغسل مرة أخرى ليصبح المجموع ثلاث غسلات لإزالة آثار الليباز. بعد غسل الخلايا ، قم بإعادة تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من وسائط D-M-E-M-F 12 مع 15٪ FBS ، ومضاد حيوي واحد X ، ينقل الخلايا إلى طبق زراعة الأنسجة 10 سم في حاضنة زراعة الأنسجة.

بعد استخراج الخلايا الليفية ، اسمح لها بالخروج من شظايا الأنسجة لتأسيس الثقافة. افحص اللوحات كل يوم بحثا عن الخلايا الليفية ولون الوسائط. إذا نجحت العزل في غضون يومين إلى خمسة أيام ، تبدأ الخلايا الليفية في الخروج.

شظايا الأنسجة ، الخلايا الليفية تزحف وتلتصق باللوحة. إذا تغير لون الوسائط إلى اللون الأصفر، فهذا يشير إما إلى تلوث محتمل أو اكتظاظ الخلايا. افحص الألواح تحت المجهر بتكبير عالي.

في حالة وجود بكتيريا أو فطريات أو ديدان ، تخلص من الألواح. هذه حقا مشكلة مع المختبر. ومع ذلك ، قد يحدث عندما يتم جمع العينات من البرية.

في حالة عدم وجود تلوث ، تحقق من اكتظاظ الخلايا. إذا كان أكثر من 60٪ من اللوحة مغطى بالخلايا الليفية المرفقة ، فقم بتغيير الوسائط الموجودة على اللوحة ونقل شظايا الأنسجة إلى لوحة جديدة. مع الوسائط الجديدة ، إن لم يكن هناك الكثير من الخلايا الليفية المتصلة باللوحة ، فقد يكون هناك عدد كبير جدا من شظايا الأنسجة الموضوعة في نفس الطبق.

في هذه الحالة ، قم بتغيير الوسائط وتقسيم قطع المناديل إلى طبقتين إلى أربع لوحات بعد سبعة أيام. إذا لم يتم تغيير الوسيط في وقت سابق ، فقم بتغييره ونقل شظايا الأنسجة إلى لوحة جديدة. مع وسائط جديدة ، احتضان الخلايا في الأنسجة لمدة سبعة أيام إضافية.

بحلول اليوم 14 ، خرجت جميع الخلايا الليفية القابلة للحياة من شظايا الأنسجة. في هذه المرحلة ، تخلص من الوسائط القديمة وشظايا الأنسجة. احصد الخلايا ووضعها على طبق جديد بمعدل خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل صفيحة في EME والوسائط مع 15٪ FPS واحد X والبنسلين والستربتومايسين والأحماض الأمينية غير الأساسية وبيروفات الصوديوم و EME والوسائط ستدعم نمو الخلايا الليفية فقط وتموت أنواع الخلايا الأخرى أو تتوقف عن التكاثر.

دع الخلايا تنمو حتى تصل إلى 80 إلى 90٪ التقاء تجميد مجموعة من الخلايا لاستخدامها في المستقبل. استمر في زراعة الخلايا عن طريق تقسيمها في خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل لوحة. عندما تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ من التقاء ، تكون الخلايا الليفية الطبيعية عبارة عن خلايا كبيرة ذات نتوءات بارزة أو لامو.

تنمو الخلايا الليفية في الشفاه في طبقة واحدة. تحتوي الثقافة الصحية المتنامية على خلية واحدة إلى 10٪ في المرحلة M معترف بها كخلايا مستديرة مرتفعة على سطح اللوحة ، ولكنها غير منفصلة عن اللوحة. عادة ما يصبح طبق طوله 10 سنتيمترات يجلس مع خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة ملتقى في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام عندما تملأ الخلايا صفيحة ، وانتشار التوقف في G مرحلة واحدة ، وهي صفيحة نموذجية ملتصقة بنسبة 100٪ من الخلايا الليفية تحتوي على طبقة معبأة بإحكام من الخلايا.

عند التقاء 90٪. الخلايا جاهزة للانقسام. يمكن أيضا الحفاظ على الخلايا على صفيحة ملتصقة مريحة لفترات طويلة من الزمن مع تغييرات منتظمة في الوسائط مرة أو مرتين في الأسبوع بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية لتخزين ودراسة الخلايا الأولية من مجموعة متنوعة من أنواع الثدييات. بعد الرغبة في هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الألياف الأولية عن الأنسجة الحيوانية. لا تنس أن عينات من البرية قد تحتوي على مسببات الأمراض.

يجب دائما اتخاذ احتياطات السلامة البيولوجية من المستوى الثاني أثناء القيام بهذا الإجراء.